动物行为与光电专题（52）丨光遗传学和化学遗传学在气味相关行为中的应用

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《动物行为实验指南》共674页，涵盖了常见的实验动物，如小鼠、大鼠和斑马鱼，详细描述了每一种行为测试的实验设计、测试设备、实验流程、评估指标、预期结果、常见问题及解决方法、数据分析、模型应用与局限性等各个方面。它通过快速引导，帮助研究人员高效地掌握实验的每个阶段，减少了查阅文献和寻找方法的时间，成为各类科研人员的重要参考资料。 《动物行为实验指南》共计收录了16种动物行为类型，包括焦虑抑郁、学习记忆、痛觉、运动、恐惧、社交、癫痫、操作、成瘾、视觉、痒觉、味觉、嗅觉、睡眠、斑马鱼行为以及常见动物模型等内容。每一类动物行为下，都详细介绍了多个经典的实验范式，涵盖了超过100种实验方法。 www.behaviewer.com

光遗传学（Optogenetics）是结合了光学（Optics）及遗传学（Genetics）的技术，能在活体动物，甚至是自由运动的动物脑内，精准地控制特定种类神经元的活动。光遗传学与其他操纵神经元技术相比它在时间的精确度和空间的精确度上更有优势，时间上可达到毫秒级别，空间能达到单个细胞级别。光遗传学基本原理，首先，通过腺相关病毒给神经元转入膜通道蛋白ChR2或者使用相关的转基因小鼠如：Vgat-ChR2等。光通道蛋白ChR2在473nm的蓝色激光照射时会打开通道，允许阳离子大量内流从而产生动作电位让神经元产生兴奋。化学遗传学全名为 Designer receptors exclusively activated by designer drugs，简称 DREADDs 实验，实验原理为用腺相关病毒（AAV）作为载体将改造过的人毒蕈碱型乙酰胆碱受体hM3Dq或hM4Di转染到表达在带有Cre 酶系的神经元细胞上，一般通过脑立体定位技术实现这一过程。在神经细胞膜表面稳定表达 hM3Dq或 hM4Di后（一般为2周以上），使用可以和细胞膜上的hM3Dq 或hM4Di蛋白特异性结合的药物叠氮平-N-氧化物（clozapine-N-oxide，CNO），CNO可以使表达 hM3Dq的神经元去极化，激活神经细胞。另一方面，使得表达hM4Di的神经元活动被抑制，兴奋性降低。

高架十字迷宫实验

本实验是评估小鼠焦虑程度最常用的实验，高架有两个开臂和两个闭臂组成，小鼠由于天生恐高，一般会呆在闭臂，但是由于好奇心也会去开臂探索。将小鼠轻轻放入高架十字迷宫的中心，面朝开臂。记录5min，统计小鼠去开臂和闭臂的时间以及焦虑相关行为学参数。每次测试后高架十字迷宫用75%的酒精彻底擦拭干净，避免小鼠留下气味对其后面的实验造成影响。实验小鼠的处理：注射AAV-hSyn-DIO-hM3Dq-mCherry和AAV-hSyn-DIO-hM4Di-mCherry病毒的转基因小鼠在注射CNO或生理盐水后30min进入气味箱给予气味（矿物油/0.1%2MT）。注射AAV-hSyn-DIO-chr2-mCherry并埋置光纤的小鼠在气味箱给予气味（矿物油/0.1%2MT）的同时全程给光，给光强度为20HZ，脉冲50ms，能量强度为10mw。频率为给光3s，停3s持续10min。箱中给与实验动物10min中的气味（2MT或矿物油）。在气味相中给予气味结束后将小鼠放回饲养笼中3min，而后进入高架十字迷宫。

皮质醇检测实验

本实验用小鼠血清进行检测，采用眼球取血的方法。分以下三个步骤：（1）实验前准备实验前一天把小鼠胡须剪掉，此步骤的目的一是避免取血时造成样本污染引起溶血。二是使小鼠适应一天，避免当天取血剪胡须引起小鼠应激反应，造成实验干扰。（2）气味刺激将实验小鼠放入气味箱给与0.1%2MT气味20min。实验小鼠的处理：注射AAV-hSyn-DIO-hM3Dq和AAV-hSyn-DIO-hM4Di病毒的转基因小鼠在注射CNO或生理盐水后30min进入气味箱给予气味。注射AAV-hSyn-DIO-chr2并埋置光纤的小鼠在气味箱给予气味的同时全程给光，给光强度为20HZ，脉冲50ms，能量强度为10mw。频率为给光3s，停3s，持续10min。

小鼠对自己天敌的气味可以产生强烈的恐惧反应，目前已经发现很多单分子物质可以模拟小鼠天敌的气味，例如捕食者尿液中提取的苯乙胺和狐狸排泄物中的2,4,5-trimethylthiazoline（TMT）等。TMT是一种比较常用的先天性恐惧的诱导气味，但其诱发的恐惧反应远小于通过学习获得的恐惧反应，因此在实验中用到了TMT的类似物—2-methyl-2-thiazoline（2MT），它能诱导出远大于TMT的恐惧反应。首先，建立了使用2MT诱发小鼠先天性恐惧的行为范式。实验前一天将小鼠放到气味箱中适应10min。实验当天，先让小鼠适应箱体3min，然后给予矿物油气味10min，之后再给予2MT气味10min，用Anymaze软件记录小鼠的运动轨迹。从轨迹图可以看出，在给予2MT时小鼠明显的回避了气味区域，而给予矿物油时小鼠对气味区域没有出现回避。一系列浓度梯度：10-9，10-7，10-5，10-4，10-3，10-2，检测不同浓度的2MT引起的回避反应。从高到低连续给予不同浓度气味刺激，每个浓度给予3min，从浓度—探索时间的拟合曲线中可以看出，随着2MT浓度的升高，小鼠探索时间逐渐下降。

2MT可以诱发小鼠的恐惧反应

实验模式和实验流程图。B：小鼠在气味测试期的运动轨迹图。上图给予气味为矿物油，下图给予气味为2MT。红色框内为软件识别的气味区域。C：2MT浓度与探索时间的关系曲线。D：分别给予矿物油和2MT刺激后，小鼠血浆中的皮质醇浓度。E：小鼠对矿物油和2MT气味的探索时间。F:小鼠在气味测试期运动的平均速度。G：小鼠在气味测试期的凝滞时间

给予2MT后小鼠去开臂区域进行的探索与对照气味相比显著减少。给予 2MT后小鼠在开臂区域探索的时间比例和平均速度出现了显著的降低，而出现凝滞行为的时间增加。

参考文献：

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• 种传刚. 小鼠外侧隔核谷氨酸能神经元在嗅觉信息介导的先天性恐惧行为中的作用[D].桂林医学院,2023.DOI:10.27806/d.cnki.gglyx.2019.000070.