《食品科学》：沈阳农业大学史海粟副教授等：豆豉纤溶酶基因的异源表达及其重组菌在淡豆豉中的应用

血栓作为心血管疾病形成的其中一个主要原因，在近年来备受关注，目前国内外应用的3 种药物均属于纤溶酶原激活剂，其通过激活血浆纤溶酶原形成纤溶酶溶解血栓，但是他们均有价格高、半衰期短等缺点。而食品源纤溶酶具有易获得、安全性高、易吸收等特点，寻找辅助溶栓的食品源溶栓酶在预防心血管疾病和干预中都起到重要作用。

豆豉纤溶酶（DFE）作为一种食品源溶栓酶，主要存在于发酵豆制品中，属于丝氨酸蛋白酶。DFE的分子质量低，可以直接在消化道中吸收，且由于DFE来源于食品，因此对人体无毒害作用。

淡豆豉作为中国一种药食同源产品，具有溶解血栓抗氧化、抗抑郁、降血糖等作用而备受关注。淡豆豉是以黑豆为主要原料，用青蒿桑叶煎煮液浸泡后自然发酵而成，因此其中微生物资源丰富，具有丰富的微生物代谢活性产物，也包括大量的纤溶酶。

酵母作为单细胞真核生物，其具有操作简单、生长迅速和发酵无有害的次级代谢产物等优点，并且在一定程度上能够实现异源蛋白的高效表达，还能进一步加工修饰合成蛋白翻译后的产物，促进蛋白质正确折叠及形成多亚基组合，使得生产的蛋白质具有生物活性，所以人们对其广泛关注并进行研究。毕赤酵母具有稳定性高、异源蛋白稳定性高的特点，因此其备受人们的关注，并被广泛应用。

沈阳农业大学食品学院的徐菁雯、乌日娜、史海粟等从淡豆豉中筛选到了高产纤溶酶的贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）20-1，并从中扩增纤溶酶基因，在毕赤酵母中异源表达，获得高产纤溶酶的重组菌株（Pichia pastorispPIC9K-his-aprEBS2），优化重组菌株的产酶发酵条件，提高菌株溶栓活性，确认菌株安全性，并将其应用于纯种发酵淡豆豉，以期提高淡豆豉中DFE含量和辅助溶栓活性。同时重组菌属于产香酵母，可以提高豆豉的风味，解决传统发酵淡豆豉风味及生理活性含量不稳定的问题，并且缩短发酵时间，提高豆豉的生理活性。

1 产纤溶酶微生物的筛选

1.1 产纤溶酶优势菌株的筛选、鉴定及纤溶酶活性的测定

根据前期宏基因结果判断，淡豆豉的主要优势发酵菌为芽孢杆菌，并根据前期研究结果 可以发现，枯草芽孢杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌等是淡豆豉中主要产纤溶酶的菌株，因此主要对芽孢杆菌进行分离与鉴定，分离出65 株淡豆豉发酵优势菌株。其中细菌56 株，包含乳酸菌17 株、芽孢杆菌39 株；真菌9 株，包含酵母菌5 株、霉菌4 株。

采用ELISA方法对具有产酶能力的菌株进行纤溶酶活力的测定，结果如表8所示。结果显示，优势菌株中纤溶酶活性最高的菌株是 B.velezensis 20-1，达到（381.18±1.39）U/mL。有研究表明，芽孢杆菌具有分泌纤溶酶的作用 ，且实验室前期研究证明， B.velezensis 20-1是豆豉发酵的主要菌株之一，说明 B.velezensis 20-1是与纤溶酶相关联的一株关键菌，该菌株可进一步应用于重组菌株的构建。

2 纤溶酶基因在毕赤酵母中的异源表达及重组菌产酶条件优化

2.1 高产纤溶酶工程菌的构建

本研究将在国家生物技术信息中心查询到纤溶酶基因序列GenBank：MH378165.1，从筛选得到的优良菌株

B. velezensis

aprEBS2

his

P. pastoris

2.4 纤溶酶体外溶栓活性

利用PCR法检测纤溶酶基因在P.pastorispPIC9Khis-aprEBS2和出发菌株中B.velezensis20-1的基因表达量。结果如图4所示，纤溶酶基因在P.pastorispPIC9Khis-aprEBS2中具有更高转录水平，在48 h达到最高，是出发菌株的5.8 倍。纤溶酶基因在P.pastorispPIC9K-hisaprEBS2和B.velezensis20-1之间有5.8 倍的表达差异，可能是由于纤溶酶基因在P.pastorispPIC9K-his-aprEBS2中被有效修饰，表明在P.pastorispPIC9K-his-aprEBS2中具有提高纤溶酶基因转录水平的能力。

2.3 纤溶酶活性分析

对出发菌株B.velezensis20-1及P.pastorispPIC9K-hisaprEBS2进行纤溶酶活性的测定，结果如图5所示，培养48 h时，酶活性达到（3 025.59±201.27）U/mL，是出发菌株的8.9 倍。

2.4 纤溶酶体外溶栓活性

由表9可知，与0.9%生理盐水作对比，初始菌株B.velezensis20-1与重组菌P.pastorispPIC9K-his-aprEBS2粗酶液对家兔血凝块有溶解作用，效果如图6所示，0.9%生理盐水、B.velezensis20-1粗酶液和P.pastorispPIC9K-hisaprEBS2粗酶液的血栓溶解率分别为（4.96±0.04）%、（43.61±0.03）%和（68.31±0.01）%，由此说明P.pastorispPIC9K-his-aprEBS2粗酶液有强烈的体外溶栓能力。相较于之前报道中齐少卿等利用乳酸菌异源表达纳豆激酶，该酶12 h血栓溶解率为66.52%，P.pastorispPIC9K-his-aprEBS2粗酶液的血栓溶解率更高。

2.5

P.pastoris

不同碳源、氮源、温度、时间、接种量及初始pH值是影响菌株产酶条件的主要因素。单因素试验结果如图7所示，麦芽糖为唯一碳源，蛋白胨+酵母浸粉为氮源时，纤溶酶酶活性最高。当其他条件一定时，随着温度的升高，纤溶酶活性相应升高，在30 ℃时达到（5 877.55±233.20）U/mL，后呈下降趋势，可能由于温度过高限制了酵母菌的生长和正常代谢。随着发酵时间的延长，纤溶酶活性逐渐增加，48 h达到最大值（6 438.49±292.69）U/mL，推测可能是由于培养时间的延长，代谢产物的积累抑制 P.pastoris pPIC9K-hisaprEBS2的生长。毕赤酵母纤溶酶活性随着初始pH值的增加呈现先上升后下降的趋势。在初始pH值为5.5时，纤溶酶活性达到最高，为（5 420.19±168.66）U/mL，可见该菌株的最适生长pH值为5.5左右。随着接种量的增加，纤溶酶活性逐渐增加，接种量为2%时纤溶酶活性达到（6 547.46±280.62）U/mL，后呈下降趋势，可见菌体总浓度过高，导致营养竞争激烈，均不利于发酵。

在单因素试验的基础上，以发酵温度（A）、发酵时间（B）、接种量（C）以及初始pH值（D）4 个因素为自变量，P.pastorispPIC9K-his-aprEBS2的纤溶酶活性（Y）为响应值，拟合得到二次多项回归方程：Y＝6 855.41-547.75×A-746.53×B+42.13×C+219.43×D+77.96×AB+173.18×AC+33.51×AD+491.23×BC+220.31×BD+108.38×CD-1 251.04×A2-1 320.07×B2-688.78×C2-1 171.91×D2，结果如表10所示。

由表11可知，数据模型差异极显著（P＜0.000 1），失拟向的P值0.878 8＞0.05，调整后R2和预测值R2的差值约为0.008 8＜0.2，信噪比为46.759 0大于4说明模型具有较高的辨识率，受误差影响小，能很好地拟合实际情况，可以用于P.pastorispPIC9K-his-aprEBS2产纤溶酶的条件参数优化。

由Design-Expert 12软件对试验结果进行响应面图的绘制，响应面和等高线组图如图8所示。

根据Design-Expert 12软件对实验进行优化预测：以酶活为最优目标得到预测酶活性为8 767.73 U/mL，4 个因素预测值分别为：温度29.80 ℃、时间44.51 h、接种量为1.97%、初始pH值为5.5。

根据软件预测结果，进行3 次重复实验，随后在该最优培养条件下进行3 次验证性实验，最终纤溶酶活性结果为（8 698.24±80.73）U/mL。

2.6 急性毒性实验

按照低、中、高剂量组和0.9%生理盐水对照组分别对受试小鼠进行灌胃，结果见表12所示，整个实验过程，14 d内均未出现小鼠死亡，临床观察也未发现小鼠有中毒症状、行为差异等异常现象。各组小鼠均生长状态良好，包括饮水、摄食及日常活动等均未见明显异常，实验动物的常规状态，包括皮肤、呼吸、鼻、眼、被毛以及各脏器组织等均未发现明显异常现象。由表13、14可以看出，各组的白细胞数目、血红蛋白浓度、血小板数目没有出现明显变化，且小鼠器官质量未有明显改变。结果表明，重组菌P.pastorispPIC9K-his-aprEBS2对雌、雄小鼠经口半数致死量均大于20 g/kgmb，根据急性毒性分级标准，重组菌实际无毒。

3 重组菌发酵在淡豆豉中的应用

3.1 淡豆豉中DFE活性

由图9可知，P.pastorispPIC9K-his-aprEBS2重组酵母菌发酵淡豆豉的纤溶酶活性高于出发芽孢菌株B.velezensis20-1发酵淡豆豉，第9天时，初始菌株B.velezensis20-1及重组菌P.pastorispPIC9K-hisa p r E B S 2 纯种发酵的淡豆豉中D F E 活性分别为（11 457.83±466.35）U/g和（17 287.02±103.20）U/g，说明P.pastorispPIC9K-his-aprEBS2纯种发酵能显著提高淡豆豉中DFE活性。

相较于之前报道中，李俊健等用中国根霉12、乳酸芽孢杆菌DU-106与毕赤酵母为发酵菌株混合发酵淡豆豉，溶栓酶活性可达（15 530.98+1 832.40）IU/g；温嘉敏等用中国根霉12经过最优工艺发酵淡豆豉，淡豆豉溶栓酶活性达（17 122+392.70）U/g；王萍等采用枯草芽孢杆菌单菌发酵淡豆豉，其纤溶酶活性达到最高值804.61 IU/g。P.pastorispPIC9K-his-aprEBS2纯种发酵的淡豆豉纤溶酶活性高于报道中纤溶酶活性，可以看出工程菌发酵淡豆豉可以显著提高纤溶酶活性。

3.2 溶栓活性分析

由表15可知，市售同仁堂淡豆豉、 B.velezensis 20-1发酵淡豆豉和 P.pastoris pPIC9K-his-aprEBS2发酵淡豆豉均对家兔血凝块有显著的溶解作用，与0.9%生理盐水相比差异显著（ P ＜0.05），其血栓溶解率分别为（14.02±1.98）%、（27.07±1.34）%和（60.55±1.58）%，说明 P.pastoris pPIC9K-his-aprEBS2发酵淡豆豉具有强烈的体外溶栓活性。

3.3 电子舌味觉测定结果

不同发酵方式会对淡豆豉品质及风味产生影响，本实验通过对比自然发酵、 P.pastoris pPIC9K-his-aprEBS2发酵及 B.velezensis 20-1发酵样品味觉构成差异判断淡豆豉成品品质。以电极活化液校准为0，3 种不同发酵淡豆豉的味觉数值大小表示味觉浓淡 。由表16、图10可知，工程菌 P.pastoris pPIC9K-his-aprEBS2发酵甜味、咸味及鲜味都有不同程度的提升，涩味有一定程度的降低，与自然发酵相比，分别提升0.16、0.19、7.8及2.06；酸味和苦味分别下降5.72和3.66。工程酵母发酵口感最佳。

3.4 感官评定结果

淡豆豉作为药食同源食品，其感官评分也尤为不同，由图11可知，发酵9 d后酵母发酵淡豆豉产品表面覆盖的菌种数量多且均匀。感官评分结果如图12所示，其中，酵母发酵淡豆豉为深褐色，颜色光亮且豆子饱满、软硬适中，具有良好的豉香和风味，其感官评分最高，为17.96 分。

3.5 色度分析

黑豆经过酵母发酵得到淡豆豉成品后，色度会发生变化，由表17可知，3 种不同发酵方式中，B.velezensis20-1发酵与P.pastorispPIC9K-his-aprEBS2发酵的淡豆豉L*和总色差（ΔE）存在显著差异，其中自然发酵淡豆豉的亮度最暗，L*值为16.30；工程菌发酵的淡豆豉最亮，L*值为27.35。自然发酵ΔE最大，为8.05。

3.6 质构分析

由表18可知，淡豆豉发酵12 d后，3 种发酵菌种的硬度有显著差异，自然发酵硬度最大，工程菌发酵硬度最小。在弹性方面，B.velezensis20-1发酵与P.pastorispPIC9K-his-aprEBS2发酵淡豆豉存在显著差异，工程菌发酵淡豆豉弹性最大，为1.26 mm。在咀嚼性方面，B.velezensis20-1发酵与P.pastorispPIC9K-his-aprEBS2发酵淡豆豉存在显著差异，自然发酵淡豆豉咀嚼性最大，为24.63 MJ。

结论

从采集的7 个地区35 份淡豆豉中共分离出65 株菌株，通过纤溶酶活性的测定，得到一株具有高纤溶酶活性的菌株，鉴定为贝莱斯芽孢杆菌（B.velezensis）2 0-1，以此为初始菌株构建高产纤溶酶的工程菌P.pastorispPIC9K-his-aprEBS2，表达水平达到原始菌株的5.8 倍，酶活性达到出发菌株的8.9 倍。同时以黑豆为原料，利用工程菌纯种发酵制备功能性淡豆豉，确定了淡豆豉最佳发酵工艺条件为：温度30 ℃、时间为9 d、接种量为2%。该条件发酵淡豆豉，DFE活性为（17 287.02±103.20）U/g，与自然发酵和B.velezensis20-1发酵淡豆豉相比，L*值最大，为27.53，硬度最小，为9.44 N，弹性最大，为1.26 mm。通过感官特性分析及电子舌分析，重组菌发酵能提高淡豆豉的感官及风味。感官评价变高，达到17.96 分。对发酵淡豆豉中DFE的溶栓效果进行研究，结果表明重组菌发酵的淡豆豉4 h后的溶栓率可达到（60.55±1.58）%，高于市售淡豆豉，说明P.pastorispPIC9K-his-aprEBS2发酵淡豆豉具有强烈的体外溶栓活性。制备出的淡豆豉具有提高活性成分的潜力，同时改善了淡豆豉的口感和风味，提高纤溶酶活性，解决了传统发酵淡豆豉风味及活性含量不稳定的问题，缩短了发酵时间，开发出一款感官良好、安全的功能性淡豆豉食品。

本研究以筛选到的优良菌株B.velezensis20-1为基础，通过PCR扩增纤溶酶目的基因，在P.pastoris中异源表达纤溶酶基因，获得高产纤溶酶的P.pastorispPIC9Khis-aprEBS2重组菌并应用于纯种发酵制备淡豆豉，提高了淡豆豉的DFE含量及溶栓活性。之后可将外源DFE、谷氨酸脱羧酶和β-葡萄糖苷酶等其他淡豆豉关键活性物质相关酶在P.pastoris中共表达，作为发酵菌株，在改善自然发酵菌株复杂的同时，进一步提高淡豆豉中的活性成分含量。

作者简介

通信作者

史海粟，副教授。博士毕业于江南大学，师从陈卫院士。沈阳农业大学食品学院微生物发酵与生物智造团队成员，辽宁省食品发酵技术工程研究中心成员。主要从事益生菌及乳品微生物及生物技术方向研究。担任国家自然科学基金评审专家，兼任中国食品科学技术学会传统酿造食品分会理事会理事，中国中药协会中药生物工程技术及产品研发专业委员会委员，《食品研究与开发》编委员会青年委员、多个SCI期刊审稿人。获“沈阳市高级人才”、“沈阳农业大学天柱山英才”称号。

主持及参与国家自然科学基金项目4 项；主持省部级和校级课题5 项。相关研究成果在

Critical Reviews in Food Science and Nutrition、Critical Reviews in Biotechnology、Food Bioscience、Journal of Lipid Research

第一作者

徐菁雯，沈阳农业大学食品学院23级博士生，21级硕博连读生，研究方向为食品生物技术，在校期间曾获得省政府奖学金，连续多年获得学业奖学金，校长奖学金，参与发表2 篇SCI论文，以第一作者发表1 篇核心期刊论文，1 项发明专利授权，1 项发明专利申请。

本文《 豆豉纤溶酶基因的异源表达及其重组菌在淡豆豉中的应用》来源于 《食品科学》2025年46卷第 4 期 68 - 80 页，作者： 徐菁雯，乌日娜，王伟明，阎亦然，向雪琴，赵玉莲，武俊瑞，王亚琦

，邓 丽，童 星，史海粟。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20240628-211。点击下方阅读原文即可查看文章相关信息。

实习编辑；云南师范大学生命科学学院 母朵银；责任编辑：张睿梅。点击下方阅读原文即可查看全文。图片来源于文章原文及摄图网。

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