FSHW | 黄芪甲苷和芦丁可恢复高脂饮食喂养的C57BL/6J小鼠的肠道微生物群失调，缓解其肥胖症状和胰岛素抵抗

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Abstract

在本研究中，探究了黄芪甲苷和芦丁的组合（CAR）对恢复肠道微生物群失调、肥胖以及肥胖相关病症的影响。将随机选取的雄性C57BL/6J小鼠实验性地分为5组，分别喂食正常饮食或高脂饮食（HFD），持续16周。与载体处理组（高脂饮食组）相比，CAR能够显著提高某些肠道微生物的丰度（阿克曼氏菌属、乳杆菌属、双歧杆菌属、罗氏菌属、普雷沃氏菌属），逆转厚壁菌门与拟杆菌门的比例，并抑制肥胖小鼠体内大肠杆菌、沙门氏菌和克雷伯氏菌的生长。此外，接受CAR处理的小鼠总短链脂肪酸的生成量显著增加，体质量增加量、器官重量、血清脂质谱（高密度脂蛋白除外）水平均有所降低，胰岛素抵抗情况也得到缓解。与高脂饮食对照组相比，在接受CAR处理的高脂饮食小鼠中，CCAAT/增强子结合蛋白-α（C/EBP-α）、甾醇调节元件结合蛋白-1c（SREBP-1c）、过氧化物酶体增殖物激活受体-γ（PPAR-γ）、乙酰辅酶A羧化酶（ACC）、脂肪细胞蛋白2（aP2）和脂肪酸合酶（FAS）的mRNA表达均下调（P＜0.05），PPAR-γ的蛋白表达下调，而5'单磷酸腺苷激活蛋白激酶（AMPK）则发生了磷酸化。有趣的是，接受CAR处理的高脂饮食小鼠的肝脏和脂肪组织的组织结构明显改善。总之，这些研究结果表明， CAR/辣木可能对治疗胰岛素抵抗和肥胖病症有益。

Introduction

肥胖流行及非酒精性脂肪肝、2型糖尿病和心血管疾病（CVDs）在内的相关病症，是主要的公共卫生挑战。不良的饮食习惯、久坐不动的生活方式、日益加剧的城市化进程以及心理社会压力，都是导致肥胖高发的因素。然而，这些因素往往难以克服，因此肥胖仍然是一个重大的健康问题。所以，探索治疗肥胖及相关病症的有效疗法具有巨大的前景。目前，美国食品药品监督管理局（FDA）和欧洲药品管理局（EMA）批准的体质量管理药物主要针对脂肪酶，或抑制食欲，或/和抑制脂肪堆积，但都存在相当大的副作用。

使用药物来管理体质量的另一种方法是调节肠道微生物群。事实上，越来越多的证据表明，人类肠道微生物群和短链脂肪酸（SCFAs）通过调节营养摄取、能量调控以及脂肪储存，在肥胖及相关疾病的发展过程中发挥作用。例如，在饮食诱导的肥胖大鼠和人类模型中，肠道微生物群发生显著变化，包括厚壁菌门/拟杆菌门等主要菌门的比例以及一些细菌种类的比例都有所上升。因此，聚焦于肠道微生物群来预防和治疗肥胖相关疾病，将会大有益处且不会产生任何不良影响。

自古以来，植物和草药一直是众多药品和营养补充剂的潜在来源，可用于治疗各种人类疾病，包括血脂异常和肥胖症。在本研究中，从辣木叶中分离出芦丁和黄芪甲苷，并评估了它们的联合作用对缓解高血糖和肥胖状况的效果。辣木富含多种维生素、矿物质和植物化学物质，包括异硫氰酸盐、芦丁、黄芪甲苷、儿茶素、山奈酚、槲皮素和绿原酸。芦丁（槲皮素-3-O-芸香糖苷）是一种黄酮醇糖苷，由槲皮素和二糖芸香糖组成，而黄芪甲苷（山奈酚-3-O-D-葡萄糖苷）是一种具有生物活性的黄酮类化合物。据报道，芦丁和黄芪甲苷具有心脏保护、抗炎、抗癌、抗糖尿病、抗过敏、抗氧化和抗艾滋病毒等特性。从作用机制上讲，黄芪甲苷被发现可抑制绝经期间老年大鼠前列腺素的产生、血管紧张素转化酶的活性以及卵巢颗粒细胞的凋亡。它还被认为可增加内源性雌激素和孕激素水平，并通过抑制NF-κB信号通路来减轻脂多糖诱导的炎症。之前对辣木粗提物及其生物活性化合物的研究在抗脂肪生成方面取得了有前景的结果。因此，本研究的目的是评估黄芪甲苷和芦丁的组合（CAR）在缓解饮食诱导的肥胖小鼠的肥胖、胰岛素抵抗以及逆转肠道微生物群失调方面的功效。我们的结果表明，CAR可能是一种用于预防和治疗肥胖的潜在药物。

Result

黄芪甲苷和芦丁的分离与纯化

黄芪甲苷和芦丁是从辣木叶的水醇提取物部分中分离得到的，然后通过反相制备高效液相色谱法（HPLC）和超高效液相色谱法（UPLC）进行了纯化、鉴定和定量分析。芦丁的光谱细节及其结构如图1所示。

CAR对体质量和食物摄入量的影响

为了观察CAR对肥胖的影响，给高脂饮食（HFD）诱导的肥胖小鼠（经口灌胃）给予剂量为20或40 mg/kg bw的CAR，将奥利司他（5 mg/kg bw）用作抗肥胖活性的阳性对照药物。如图2所示，与正常饮食喂养的组相比，喂食高脂饮食的小鼠体质量随着时间显著且稳定地增加（增加了53.74%）。然而，口服CAR可使高脂饮食喂养的小鼠体质量增加量显著且呈剂量依赖性地减少（P＜0.05）。在CAR剂量为40毫克/千克时观察到体质量增加量的最大减少，且这与喂食高脂饮食并接受奥利司他治疗的组相近（图2A和B）。然而，在CAR处理组的食物摄入量方面未观察到显著差异（图2C），这表明CAR可以在不影响食物摄入量的情况下减少小鼠的体质量增加量。

CAR对胰岛素抵抗和葡萄糖稳态的影响

为了研究CAR是否能减轻高脂饮食喂养小鼠的葡萄糖不耐受和胰岛素抵抗，在给小鼠用CAR处理第4周和第5周后，进行了口服葡萄糖耐量试验（OGTT）和胰岛素耐量试验（ITT）。高脂饮食对照组的葡萄糖和胰岛素水平明显高于正常饮食喂养组。然而，与未处理的高脂饮食组相比，剂量为40 mg/kg bw的CAR组显著改善了受损的葡萄糖和胰岛素耐受性（P＜0.05）（图3A-D）。此外，高脂饮食对照组未观察到胰岛素的降血糖作用（与正常对照组相反），而CAR处理组在注射胰岛素后血糖明显降低。另外，在OGTT和ITT试验中，接受CAR处理的小鼠均表现出剂量和时间依赖性反应。与这些结果一致的是，图3E展示了高脂饮食对照组和肥胖治疗组小鼠脂肪组织中磷酸化5'-单磷酸腺苷激活蛋白激酶（p-AMPK）和过氧化物酶体增殖物激活受体-γ（PPAR-γ）的蛋白表达水平。用CAR处理可通过其磷酸化来激活AMPK，然而，与高脂饮食对照组小鼠相比，在剂量为20和40 mg/kg bw的CAR处理下，高脂饮食喂养的肥胖小鼠的PPAR-γ表达下调。这些发现表明，CAR在维持能量稳态的同时，还能减少脂肪组织中的脂肪生成。

CAR对脂肪组织和肝脏组织病理学的影响

对用苏木精和伊红染色的肝脏和脂肪组织切片，通过光学显微镜在40倍放大倍数下进行观察。喂食高脂饮食的对照组的肝脏组织切片显示出脂滴积累、炎性细胞存在、细胞核缺失以及肝细胞严重肿胀的情况。与正常对照组相比，高脂饮食对照组小鼠的脂肪组织切片显示出脂肪细胞增大，有脂滴储存且细胞边界塌陷。给予CAR（40 mg/kg bw）显著减小了脂肪细胞的大小和脂类储存量，这揭示了其在维持脂肪组织结构完整性方面的抗肥胖作用（图4）。关于肝脏组织，用CAR（40 mg/kg bw）处理的高脂饮食喂养组显示出脂质积累减少，肝脏组织结构得到改善，这表明CAR处理起到了保护和恢复作用（图5）

CAR对与脂肪生成和脂质生成相关基因mRNA表达的影响

为了在基因水平上评估CAR的作用，使用qRT-PCR测量了与脂肪生成和脂质生成相关的关键基因的mRNA表达水平。如图6A-F所示，给予CAR显著且呈剂量依赖性地下调了乙酰辅酶A羧化酶（ACC）、脂肪酸合成酶（FAS）、甾醇调节元件结合蛋白-1c（SREBP-1c）、脂肪细胞脂肪酸结合蛋白（aP2）、CCAAT/增强子结合蛋白-α（C/EBP-α）和PPAR-γ的表达，并且在剂量为40mg/kg bw时观察到的作用最为显著。因此，CAR可以通过调节上述信号分子和转录因子，抑制高脂饮食喂养小鼠的脂肪生成和脂质生成。

CAR对肠道微生物群和短链脂肪酸的影响

此外，在门和属的水平上评估了肠道微生物群的变化。在喂食正常饮食的小鼠、喂食高脂饮食的小鼠以及接受CAR处理的小鼠之间，观察到了肠道微生物群组成和丰度的明显差异（图7A和B）。在喂食高脂饮食的对照组中，观察到厚壁菌门水平升高，而拟杆菌门水平降低，而接受CAR处理的高脂饮食组则显示出厚壁菌门水平降低，拟杆菌门水平升高（P＜0.001）。此外，CAR在属的水平上增加了有益细菌的丰度，如阿克曼氏菌属（Akkermansia）、普雷沃氏菌属（Prevotella）和罗氏菌属（Roseburia），但减少了革兰氏阴性有害细菌，如大肠杆菌（E. coli）、肠杆菌属（Enterobacter）、沙门氏菌属（Salmonella）和克雷伯氏菌属（Klebsiella）。然而，与喂食高脂饮食的对照小鼠相比，对革兰氏阳性的乳酸杆菌属（Lactobacillus）和双歧杆菌属（Bifidobacterium）的丰度没有观察到太大影响（图7B）。对盲肠内容物的分析表明，喂食高脂饮食的组中，乙酸、丙酸、丁酸和乳酸等SCFAs的水平下降，而20和40 mg/kg bw的CAR处理都能使这些短链脂肪酸水平恢复（图8）。

Conclusion

综上所述，从辣木叶中分离出的CAR已显示出对肠道微生物群失调的修复潜力。此外，CAR可增加SCFAs的产生，并通过调节PPAR-γ和AMPK介导的信号通路，对高脂饮食诱导的肥胖小鼠模型表现出潜在的抗肥胖和胰岛素增敏作用。因此，CAR可能是一种潜在的天然物质，对预防和治疗肥胖相关病症有益。

Astragalin and rutin restore gut microbiota dysbiosis, alleviate obesity and insulin resistance in high-fat diet-fed C57BL/6J mice

Muni Swamy Ganjayia,b, Karunakaran Reddy Sankarana, Balaji Merigaa,*, Ruchika Bhatiac, Shikha Sharmac, Kanthi Kiran Kondepudic

a Department of Biochemistry, Sri Venkateswara University, Tirupati 517502, India

b Department of Biomedical Sciences, Heritage College of Osteopathic Medicine, Ohio University, Athens 45701, United States

c Food and Nutrition Biotechnology Division, National Agri-Food Biotechnology Institute, SAS Nagar, Punjab 140306, India

*Corresponding author.

Abstract

In the present study we investigated the impact of the combination of astragalin and rutin (CAR) on restoring gut-microbial dysbiosis and obesity and obesity related disorders. Randomized male C57BL/6J mice were experimentally divided into 5 groups and fed either a normal diet or a high-fat diet (HFD) for 16 weeks. Compared to vehicle treated group (HFD group), CAR could substantially improve selected gut microbiota abundance (Akkermansia, Lactobacillus, Bifidobacteria, Roseburia, Prevotella), reversed the Firmicutes/Bacteroidetes proportions, and inhibited the growth of Escherichia coli, Salmonella, and Klebsiella in obese mice. In addition, CAR-treated mice showed significantly increased total short-chain fatty acid production, reduced body weight gain, organs’ weights, serum lipid profile (except HDL) and insulin resistance. The mRNA expressions of CCAAT/enhancer binding protein-α (C/EBP-α), sterol regulatory element-binding protein-1c (SREBP-1c), peroxisome proliferator-activated receptor-γ (PPAR-γ), acetyl-CoA carboxylase (ACC), adipocyte protein 2 (aP2), and fatty acid synthase (FAS) were downregulated (P < 0.05) and the protein expression of PPAR-γ was downregulated while adenosine 5’ monophosphate-activated protein kinase (AMPK) was phosphorylated in CAR-treated HFD-fed mice compared to the HFD control group. Interestingly, CAR-treated HFD-fed mice showed significantly improved tissue architecture in the liver and fatty tissues. In conclusion, the findings suggest that CAR/Moringa oleifera may be beneficial in the treatment of insulin resistance and obesity disorders.

Reference:

GANJAYI M S, SANKARAN K R, MERIGA B, et al. Astragalin and rutin restore gut microbiota dysbiosis, alleviate obesity and insulin resistance in high-fat diet-fed C57BL/6J mice[J]. Food Science and Human Wellness, 2024, 13(6): 3256-3265. DOI:10.26599/FSHW.2023.9250012.

翻译：王立磊（实习）

编辑：梁安琪；责任编辑：孙勇

封面图片：图虫创意

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