Adv Mater：三七中三萜类皂苷自组装水凝胶及其抗真菌作用

摘要

天然产物是药物发现的重要资源，但对其自组装形成可溶性、生物可利用性水凝胶的分子尺度机制理解不足，限制了其应用和治疗潜力。研究表明，来源于三七的三萜类皂苷 R1 (ZR1) 能自发自组装形成由螺旋纳米纤维组成的水凝胶，其具有单体状态所缺乏的强抗真菌活性。冷冻电子显微镜 (cryo-EM) 揭示了促进 ZR1 纳米纤维形成的复杂氢键网络，其特征为疏水核心和亲水外壳结构，支撑了其与外阴阴道念珠菌病 (VVC) 病原体 —— 白色念珠菌细胞壁的结合活性。ZR1 凝胶与葡聚糖之间的氢键界面破坏了膜完整性，在体外抑制了白色念珠菌的增殖，并在 VVC 模型小鼠中发挥作用。ZR1 凝胶还能递送益生菌乳酸杆菌，协同抑制 VVC 并恢复阴道微环境。本研究推进了对 ZR1 结构 - 功能关系的机制理解，为基于天然产物的水凝胶的合理设计和治疗优化提供了宝贵见解。

1. 引言

天然产物一直以来都是开发治疗多种疾病的治疗剂的宝贵资源。尽管天然产物具有显著的治疗潜力，但溶解性和生物利用度方面的限制极大地阻碍了众多天然化合物的转化应用。为克服这些挑战，人们探索了多种药物递送系统，如基于天然产物或其衍生物的自组装水凝胶因其生物相容性、易生产、副作用小、药物载荷高和持续释放特性而受到越来越多的关注。然而，由于对给定化合物形成水凝胶的能力难以预测，自组装水凝胶的合理设计仍然复杂且具有挑战性。实现稳定且功能性的水凝胶需要在特定条件下精确平衡疏水和亲水相互作用。传统的可视化方法，如负染透射电子显微镜 (TEM) 和原子力显微镜 (AFM)，虽然能够揭示纳米级基质结构，但缺乏捕捉分子级相互作用动态所需的分辨率。为规避这些方法限制，冷冻电子显微镜 (cryo-EM) 应运而生。在本研究中，作者发现 ZR1 可自组装成具有显著抗真菌活性的分子水凝胶，而其自由分子形式则不具备这种活性。利用 cryo-EM，我们确定了 ZR1 凝胶的分子结构，揭示了促进 ZR1 单体自组装成纳米纤维的复杂氢键网络。这些纳米纤维具有疏水核心和亲水表面，可结合并破坏白色念珠菌的膜完整性。我们还发现 ZR1 水凝胶可递送益生菌乳酸杆菌菌株，协同抑制白色念珠菌生长，恢复小鼠模型的阴道微环境。

2. 结果与讨论 2.1 ZR1 凝胶的制备与表征

通过简单的加热 - 冷却方法在 PBS 缓冲液中制备 ZR1 水凝胶，最低凝胶浓度为 2.0 wt%。30 分钟内可观察到形成透明自支撑水凝胶。后续的负染透射电子显微镜 (TEM) 成像显示水凝胶基质由宽度 ≈5 nm 的均匀纳米纤维组成。扫描电子显微镜 (SEM) 表面表征显示基质具有多孔内部结构。X 射线衍射光谱 (XRD) 显示水凝胶中出现明显的衍射峰，表明分子排列高度有序，而 ZR1 粉末中则不存在。傅里叶变换红外光谱 (FTIR) 显示 O—H 伸缩振动增强，羧基不对称和对称 C═O 伸缩振动发生红移，表明氢键参与了组装过程。此外，ZR1 凝胶表现出 -38.3 ± 0.47 mV 的 zeta 电位，表明其稳定性高于溶液相 ZR1。振荡流变分析进一步定义了 ZR1 凝胶的粘弹性特性，显示出剪切变稀 / 恢复能力。水凝胶还可通过注射器保持形状，支持其作为药物递送载体的潜力。此外，ZR1 凝胶在猪皮模型中表现出粘附性，并对 Caco-2 细胞表现出良好的生物相容性，表明其满足进一步测试用于生物医学应用的基本标准。这些发现表明 ZR1 可自组装成具有潜在治疗和生物医学用途的水凝胶。

2.2 ZR1 纳米纤维的冷冻电镜结构

为阐明 ZR1 凝胶的自组装机制，利用冷冻电镜对其进行结构研究。在测试了各种 ZR1 浓度和冷冻条件后，冷冻电镜图像显示 ZR1 分子聚合成直径约为 50 Å 的延伸管状纳米纤维。参考自由的 2D 分类显示在约 40 Å 间隔处出现重复的高分辨率特征，宽度约为 45.8 Å，表明有序的螺旋排列。这些螺旋特征在对齐的 ZR1 段的平均功率谱中也很明显，弱层线延伸到 4.3 Å 分辨率。基于第一层线与赤道之间的距离，推断出 38.6 Å 的螺旋重复长度，与 2D 平均观察到的周期性重复特征一致。通过进一步的功率谱索引，提供了用于基于试错法的 3D 地图重建螺旋纳米纤维的可能对称性。由于 ZR1 作为一种小分子缺乏二级结构，因此在冷冻电镜中确定其正确手性是一个独特挑战。为解决此问题，构建了左手和右手冷冻电镜地图配置的原子模型，并在实空间中进一步细化。结果显示，手性 ZR1 分子只能准确拟合到左手地图中，证实这是正确的手性。基于地图，我们重建了 ZR1 纳米纤维，其整体分辨率为 2.5 Å，螺旋升角为 1.7 Å，扭转角为 -93.4°。该 3D 重建图显示了一个 4 起始螺旋，螺距为 154.4 Å，投影重复长度为 38.6 Å，与功率谱分析一致。地图清晰显示了三萜核心和双糖基团的密度，从而允许构建可靠的原子模型。每个非对称单元 (ASU) 包含两个 ZR1 分子，四个 ASU 沿纳米纤维周长跨越以完成一个螺旋周期。

2.3 ZR1 凝胶的体外抗真菌活性

基于三萜皂苷的抗真菌效果，研究了 ZR1 作为天然三萜皂苷，以白色念珠菌为对象，研究其单体溶液或水凝胶形式是否具有抗真菌活性。平板计数显示，与 2.0% ZR1 溶液相比，ZR1 凝胶处理后的菌落形成单位 (CFUs) 显著减少，两种处理均比未处理组显著减少 CFUs。测试了 2.0% ZR1 凝胶和溶液在 1×10²−10⁷ CFUs 的一系列接种密度下的效力。平板计数再次表明，即使在 1×10⁷ CFUs 的接种密度下，2.0% ZR1 凝胶也能更有效地抑制白色念珠菌的增殖。这些结果表明 ZR1 凝胶确实具有抗真菌特性，促使我们进一步探索其作用机制。扫描电子显微镜 (SEM) 成像显示，ZR1 凝胶处理后的白色念珠菌细胞形态和超微结构受损、变形或膜完整性受损，而未处理的白色念珠菌细胞则呈卵圆形、表面光滑。透射电子显微镜 (TEM) 图像进一步说明了未处理的白色念珠菌的完整结构和均匀分布的细胞质，而 ZR1 凝胶处理后的细胞则显示出细胞内含物泄漏和细胞膜与细胞壁分离。为更好地了解 ZR1 凝胶对白色念珠菌细胞膜通透性的影响，还进行了碘化丙啶 (PI) 和 Syto 9 染色的共聚焦激光扫描显微镜 (CLSM) 实验。结果显示，ZR1 凝胶组的 PI 信号显著更强，表明 ZR1 凝胶处理后白色念珠菌细胞的膜通透性明显增加。与未处理对照组相比，Syto 9 荧光信号降低，进一步支持了 ZR1 凝胶处理导致膜完整受损的结论。总体而言，这些发现表明 ZR1 凝胶可显著破坏白色念珠菌的细胞膜完整性，导致细胞死亡增加。

2.4 ZR1 凝胶抗真菌特性的分子见解

鉴于 ZR1 凝胶在破坏白色念珠菌细胞膜方面比 ZR1 溶液更有效，推测 ZR1 在纳米纤维中的组织可能在这一效果中起着关键作用。为探索 ZR1 纳米纤维如何破坏白色念珠菌膜的机制，对 ZR1 纳米纤维的 3D 结构进行了全面分析。纵向平行于纳米纤维轴的视图显示，沿螺旋轴的分子包装主要通过羧基与相邻 ASU 内的羧基氧和羟基氧之间的氢键稳定。垂直轴向的俯视图显示，三萜核心朝向内部，而双糖基团暴露在表面，这可能促进相邻链之间的羧基和羟基氧之间的氢键形成。这种结构排列可能使 ZR1 分子将疏水基团封装在纳米纤维核心内，同时将亲水双糖基团呈现在外部，从而促进与细胞膜的相互作用并破坏细胞膜。为更好地定义其抗真菌作用机制，采用基于 DFT 和 MD 模拟来研究 ZR1 纳米纤维与白色念珠菌细胞膜的相互作用。DFT 计算和基于 Hirshfeld 分区的 IGMH 分析显示 ZR1 与葡聚糖之间存在强氢键，相互作用能约为 -0.76 eV，表明结合亲和力高。这些结果表明，白色念珠菌细胞壁中的 β-1,3-葡聚糖可能作为 ZR1 凝胶抗真菌活性的潜在靶点。此外，使用 1- 棕榈酰 -2- 油酰 -sn- 甘油 -3- 磷酰胆碱 (POPC) 作为模型膜的 MD 模拟表明，在 100 ns 模拟中 ZR1 纳米纤维可与 POPC 分子发生显著相互作用。鉴于真菌细胞膜的结构复杂性，我们构建了一个更具代表性的模型进行进一步模拟，结果也证实了 ZR1 与真菌细胞膜之间的相互作用。这些模拟表明，ZR1 纳米纤维可通过氢键吸附到膜表面，导致膜变形和厚度从均匀分布转变为异质分布，出现特征性薄区和结构坍塌，最终破坏真菌细胞膜的完整性。总体而言，这些计算分析支持 ZR1 纳米纤维的双重作用机制，即它们特异性识别并结合细胞壁葡聚糖，使其靠近白色念珠菌细胞膜，然后通过结构扰动破坏其完整性。

2.5 ZR1 凝胶中益生菌的包封

为探索 ZR1 凝胶作为临床药物递送载体的潜力，研究了 ZR1 凝胶是否可作为递送益生菌乳酸杆菌鼠李糖亚种 GG (LGG) 的载体，以抑制白色念珠菌增殖并恢复阴道微生物组的健康平衡。使用刚果红染色和绿色荧光模型菌株 EcN-GFP 融合报告基因的 CLSM 成像确认 LGG 细胞在 ZR1 凝胶中均匀包封。随后的 SEM 成像也显示益生菌 LGG 细胞在 ZR1 凝胶中均匀分布。研究了 ZR1 包封的 LGG (LGG@ZR1) 的活性。37°C 下液体培养基中自由 LGG 和 LGG@ZR1 的生长曲线在任何时间点均无显著差异，表明 ZR1 不干扰 LGG 增殖。这可能是因为 LGG 作为革兰氏阳性菌，其细胞壁主要由肽聚糖和磷壁酸组成，而白色念珠菌的细胞壁主要由葡聚糖、甘露聚糖和几丁质组成。此外，累积释放曲线显示，24 小时内 32% 的益生菌从 ZR1 凝胶中释放，表明其具有持续释放的能力。由于乳酸杆菌已知可通过产酸、分泌过氧化氢和竞争性粘附等机制抑制白色念珠菌并维持阴道稳定性，因此进一步评估了 LGG@ZR1 是否可抑制白色念珠菌。真菌平板实验表明，LGG@ZR1 处理后的白色念珠菌 CFUs 显著减少，表明具有抗真菌活性，而单独的 LGG 对白色念珠菌增殖的抑制效果有限。此外，含 LGG@ZR1 的 MRS 培养基的 pH 值降至约 4.2，支持其恢复酸性阴道微环境的潜力。这些发现表明 LGG@ZR1 可在体外抑制白色念珠菌，支持其作为治疗 VVC 的潜在疗法进行体内筛选。

2.6 LGG@ZR1 对小鼠 VVC 的抑制作用

为探索 ZR1 凝胶作为局部抗真菌剂和益生菌递送载体的临床应用潜力，在 VVC 小鼠模型中评估了其疗效，并将临床批准的小分子抗真菌药物伊曲康唑作为对照。实验中，雌性 BALB/c 小鼠每两天皮下注射苯甲酸雌二醇溶液以建立感染易感性，随后通过阴道接种 2×10⁷ CFUs 白色念珠菌诱导 VVC。确认感染成功后，对感染小鼠连续 9 天进行阴道内给予 LGG、ZR1 凝胶、LGG@ZR1 或伊曲康唑治疗。收集阴道冲洗液进行菌落计数和微生物组分析，并对处死小鼠的阴道组织进行组织化学病理分析。结果显示，所有白色念珠菌感染小鼠均表现出 VVC 症状，包括阴道红肿（炎症）和分泌物增多。在 LGG@ZR1 治疗组中，炎症在第 5 天明显减轻，分泌物减少，红肿几乎完全消失。相比之下，未治疗组的炎症在第 9 天逐渐改善。阴道冲洗液的菌落计数进一步表明，LGG@ZR1 和伊曲康唑组的白色念珠菌丰度显著低于对照组。第 9 天在选择性琼脂平板上对阴道冲洗液中的白色念珠菌进行培养，结果显示 LGG@ZR1 治疗减少了真菌细胞的活性和集落形成能力。各治疗组小鼠体重无显著差异，且对主要器官（心、肝、脾、肺和肾）的组织病理学分析未发现不良影响。由于感染通常会触发宿主免疫反应，包括 T 淋巴细胞亚群的变化，这些细胞对病原体特异性抗性和免疫调节至关重要，且免疫细胞功能依赖于成熟淋巴细胞（CD3+ 细胞）及其亚群（即 CD4+ 辅助 T 细胞和 CD8+ 细胞毒性 T 细胞）的总丰度，因此在第 5 天评估了阴道组织中 T 淋巴细胞水平，以评估 LGG@ZR1 治疗后的免疫反应。免疫荧光分析显示，白色念珠菌感染确实诱导了免疫反应，对照组小鼠的 T 淋巴细胞水平显著高于健康小鼠。值得注意的是，LGG@ZR1 处理的小鼠中 CD3+、CD4+ 和 CD8+ T 细胞的丰度显著高于 PBS 处理的对照组小鼠，表明 LGG@ZR1 可能刺激这些 T 细胞群。组织病理学分析（H&E 和 PAS 染色）进一步评估了 LGG@ZR1 的治疗效果，显示 LGG@ZR1 组阴道上皮形态正常，无损伤或炎症迹象。相比之下，PBS 处理的小鼠表现出明显的上皮破坏和大量中性粒细胞浸润，表明与真菌感染相关的持续炎症。PAS 染色显示 LGG@ZR1 处理组几乎无真菌，与健康对照组相似，而其他治疗组仍有残留真菌感染。这些结果表明 LGG@ZR1 可有效改善小鼠的 VVC。VVC 通常与阴道微生物组的紊乱有关，其特征为生物多样性降低，包括厚壁菌门显著减少，同时变形菌门增加。由于乳酸杆菌在维持阴道稳定性中起着关键作用，因此还研究了 LGG@ZR1 是否有助于恢复健康的阴道微生物组。对各治疗组小鼠的阴道冲洗样本进行 16S rDNA 测序，结果显示 LGG@ZR1 处理的小鼠阴道微生物组的丰富度（OTU）和 α- 多样性、β- 多样性显著高于伊曲康唑处理动物，与健康组相似。在门水平上，LGG@ZR1 处理导致厚壁菌门相对丰度显著增加，变形菌门减少，表明微生物组谱更接近健康阴道条件。这些结果表明，ZR1 凝胶或 LGG@ZR1 对小鼠 VVC 的治疗效果优于伊曲康唑，LGG@ZR1 治疗后效果更强，包括减少炎症和恢复阴道微生态平衡。这些发现支持进一步探索 LGG@ZR1 作为治疗 VVC 和恢复阴道失调的治疗干预措施。

3. 结论

以三七中提取的三萜皂苷类天然产物 ZR1 为例，研究发现 ZR1 可自组装成水凝胶，无需进一步结构修饰。利用冷冻电镜确定了 ZR1 纳米纤维在 2.5 Å 分辨率下的原子结构，这是迄今为止首次报道由天然产物形成的冷冻电镜定义的纳米纤维结构。ZR1 的自组装对增强其抗真菌活性至关重要。这种三级结构增加了活性 ZR1 分子的局部浓度，便于与真菌细胞更有效地相互作用。纳米纤维表面暴露的亲水基团便于膜附着，通过分子相互作用破坏真菌细胞膜。此外，ZR1 凝胶作为乳酸杆菌的递送系统，提供双重作用机制。包封的益生菌协同抑制白色念珠菌，同时恢复阴道微生物组，这对于降低复发率至关重要。这种双重作用方法为 VVC 提供了更全面的治疗策略，同时解决了真菌过度生长和微生物组恢复问题。此外，ZR1 凝胶系统可能还有潜力用于治疗口腔念珠菌病和真菌性肠炎，扩大其临床应用范围。本研究将 ZR1 凝胶引入作为一种多功能治疗平台，结合抗真菌和益生菌递送能力。ZR1 纳米纤维的独特结构特性是其增强生物活性的核心，为克服天然产物常见的限制提供了有希望的方法。本研究为天然产物的自组装提供了有价值的见解，并为基于天然产物的水凝胶设计开辟了新的途径。