Nat. Chem. | 上海交大瞿旭东/赵一雷团队发现首例双氧杂Diels-Alder酶

导读

近日，生命科学技术学院、张江高等研究院瞿旭东 团队联合澳大利亚昆士兰大学Mehdi Mobli团队、上海交通大学生命科学技术学院赵一雷团队及孔旭东团队，在《Nature Chemistry 》发表题为“An enzymatic dual-oxa Diels-Alder reaction constructs the oxygen-bridged tricyclic acetal unit of (-)-anthrabenzoxocinone”的研究论文，首次揭示了一种新型双氧杂Diels-Alder (HDA)酶的催化机制，该酶负责II型聚酮天然产物(-)-anthrabenzoxocinone（(-)ABX）中手性三环缩酮氧桥结构单元的形成。生命科学技术学院博士后闫晓丽与昆士兰大学贾新颖博士为论文共同第一作者，瞿旭东教授、Mehdi Mobli教授以及赵一雷教授为论文共同通讯作者；孔旭东长聘教轨副教授，籍顺佳和张梦洁等同学为共同作者。本推送将对该研究的计算部分进行详细解读。

研究背景

异杂Diels–Alder（HDA）反应是一种高效构建六元杂环结构的经典手段，广泛应用于活性天然产物的合成。尽管HDA反应在化学合成中已有成熟应用，但自然界中仅有少数能够催化HDA反应的酶，且仅限于单一杂原子的反应体系。

自然界中存在一类具有氧桥三环缩醛结构的天然产物，具有多种生物活性，但其生物合成机制仍不清楚。受到化学合成中以邻醌亚甲基（o-QM）与羰基发生[4 + 2]环加成生成氧桥三环结构的启发，研究者推测自然界中可能存在能催化双氧杂DA反应(dual-oxa DA)的酶。以(−)-ABX为代表的这类化合物，通过化学合成产物为外消旋体且产率不高，探索其天然生物合成机制具有重要意义。

研究内容

研究人员此前已确定了(-)-ABX 的芳香骨架 PDA 相关的生物合成基因簇，但其核心结构氧桥三环缩醛的酶促形成机制仍未明确。通过实验研究人员推测，前体1先被 Abx(−)E 立体专一性还原为 (8S)-2，然后通过 Abx(−)F 的催化高效且专一地转化为 (-)-ABX，若无 Abx(−)F 则会缓慢自发生成 (+)-ABX 和 (−)-ABX 的混合物。本研究通过实验和理论计算系统揭示了天然产物 (−)-ABX 中独特的氧桥三环缩醛结构的形成机制。

图1（-）-ABX形成氧桥三环缩醛的关键步骤。

研究发现，氧桥三环缩醛结构并非通过传统的脱水环化或SN1、SN2机制生成，因为这些路径无法解释最终产物的手性构型，也不符合同位素实验的结果。本研究提出并验证了一种全新机制：Abx(−)E 催化前体化合物1还原为中间体2；随后，在 Abx(−)F 的催化下，2脱水生成具有轴手性的 o-QM中间体3，再通过高选择性的dual-oxa DA反应形成 (−)-ABX 的三环结构。

图22到(−)-ABX的势能面

为了验证上述提出的机制，进行了DFT 计算。在非酶环境中，8-OH的消除可以通过邻位酚（6-OH）基团的质子供给来促进。由于新形成的C7=C8双键会产生轴手性，中间体3可能存在两种过渡态，TS1DH和TS2DH（图2和图3a,b）。计算分析表明，脱水反应发生在化学过程的较晚阶段，此时6-OH的质子转移几乎完成，因此邻位位置会积累显著的负电荷。这使得在TS1DH中蒽酰羟基呈反式取向相比于TS2DH中的顺式取向更加有利，能量差约为2.5 kcal/mol（图2和图3a,b）。这意味着将主要生成(Ra)-3。进一步的8-OH脱水被计算为放能反应，能量释放为4.4 kcal/mol，这主要归因于一个分子分解为两个分子所带来的熵增益。对于oxa-DA反应，中间体3中的o-QM基团和24位羰基（C24=O）可能有四种合理的取向（图3c），这取决于C7=C8双键的E/Z构型以及C24取代基的exo/endo取向。然而，由于C9和C22之间的芳香键连接，实际上只有两种取向能够成为可行的过渡态，即TSEDA和TSZDA（图3 d, e）。这两种过渡态分别会生成(R-C8, S-C24)、(S-C8, R-C24)和(R-C8, R-C24)、(S-C8, S-C24)的DA加成产物。虽然这两种过渡态在几何上均可行，但TSEDA在能量上无法达到，其能量比TSZDA高出38.0 kcal/mol（图3e）。因此，只有TSZDA的加成产物可以生成，即(−)-ABX (R-C8, R-C24)和(+)-ABX (S-C8, S-C24)，这一结果与实验结果一致。

图3QM计算支持并解释了Abx(-)F的立体特异性dual-oxa DA环化反应

随后，为了理解中间体3在Abx(−)F的存在下如何专一性地发生oxa DA反应，我们利用理论酶模型探讨了Abx(−)F可能的反应机制。假设酶促脱水与非酶促脱水的内在反应能量相同，根据理论酶模型，形成预反应态（PRS）大约需要8.7 kcal/mol的能量（图3a,b）。结合过渡态TS0DH的能量信息，模型预测酶促反应的整体能垒不会超过16.3 kcal/mol，比非酶促反应低3.2 kcal/mol，这相当于在Abx(−)F存在下反应速率提升了约226.7倍。

为了深入了解Abx(−)F的催化机制，本研究确定了该酶的晶体结构，并通过NMR分析确定了Abx(−)F的结合位点。进一步研究表明，(−)-ABX通过π–π堆积作用与Abx(−)F的特定区域结合，关键的氨基酸残基通过稳定底物构象，促进脱水和双氧-DA反应。此外，芳香环的构象发生重要变化，旋转约90°，使6-OH基团形成关键氢键，这一过程通过分子动力学模拟得到验证。通过突变Abx(−)F的关键残基，确认D17在脱水反应中至关重要，可能作为通用碱促进6-OH去质子化并促进8-OH的离去。W15、Y48、Y78和S60与立体控制相关，因为它们在oxa DA反应中影响(+)-ABX的生成。

图4ONIOM计算Abx(-)F中的催化机理

为了进一步揭示Abx(-)F在oxa DA反应中的作用，使用ONIOM方法模拟了蛋白质中的过渡态TSZDA（图4）。计算得出Abx(-)F中的反应势垒为 9.6 kcal mol-1，远低于水溶液中估计的 17.4 kcal mol-1（图2），证实了Abx(-)F作为DA酶的作用。D17羧基的羟基通过桥接水分子与C24羧基形成氢键，从而降低了亲二烯的电荷密度，使DA反应更加有利。W15和S60与D17形成了一个扩展的氢键网络，从而提高了酶-底物复合物的几何稳定性。此外，两个β片上的相邻残基（包括 W125、I105、Y48、Y78、Q108、T131、M50、L106和M111）产生了模板效应，将TSZDA的蒽基基团紧密地固定在DA 反应中。然后，L64-G73环的动态运动为在DA反应中翻转苯环提供了必要的空间。

通过整合实验和计算数据，本研究提出了Abx(-)F催化的oxa DA反应的两步机制。S60侧链首先与D17形成氢键，以增强羧基的碱性，而羧基则作为一般碱基使化合物2的酚基6-OH去质子化。去质子化会引发分子内部的重排，包括新生苯氧基阴离子的电子迁移以及8-OH的质子化和脱水，从而形成能量有利的(Z，Ra)-3。最后，在Abx(-)F底物结合袋的限制下，(Z, Ra)-3采用一种特定的受限构象（TSZDA），发生oxa DA反应，生成（-）-ABX。

总结

（1）实验首次发现并鉴定了一种可催化双氧杂狄尔斯–阿尔德（dual-oxa DA）反应的天然酶Abx(−)F，该酶来自一种类邻位氧螯合（VOC）蛋白家族，具备双功能催化活性，既能催化底物脱水，又能立体选择性地促使[4+2]环加成反应，成功构建了(-)-anthrabenzoxocinone（(-)-ABX）中的氧桥三环缩醛结构。这是首次报道自然界中存在可催化含两个氧杂原子的多杂原子DA反应的酶，突破了此前仅能处理单一杂原子DA反应的局限。

（2）实验通过晶体结构解析、核磁共振（NMR）复合物结构分析、同位素标记实验及密度泛函理论（DFT）计算，深入揭示了Abx(−)F催化反应的分子机制。研究发现，该酶通过Asp17残基作为一般碱，启动底物脱水生成o-苯醌甲基（o-QM）中间体，进而诱导双氧杂DA反应的发生。

（3）结构分析明确了酶与底物及产物的结合方式，为其立体选择性提供了结构基础。该研究不仅验证了酶催化复杂多杂原子环加成反应的可行性，也预示了自然界中或许还存在其他类似的多杂原子DA酶，为今后的酶工程和天然产物合成提供了新思路和工具。

文献详情：

An enzymatic dual-oxa Diels–Alder reaction constructs the oxygen-bridged tricyclic acetal unit of (–)-anthrabenzoxocinone

Xiaoli Yan, Xinying Jia, Zhenyao Luo, Shunjia Ji, Meng-Jie Zhang, Hui Zhang, Mingjia Yu, Julien Orts, Kai Jiang, Zhi Lin, Zixin Deng, Xu-Dong Kong, Bostjan Kobe, Yi-Lei Zhao, Mehdi Mobli & Xudong Qu

Nat. Chem.2025

https://doi.org/10.1038/s41557-025-01804-0

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