Neuron：孩子天生耳聋能治好吗？上海科技大学钟桂生团队揭示高效外毛细胞靶向增强子机制

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遗传性听力损失约占先天性耳聋的60%。尽管腺相关病毒（AAV）介导的基因治疗在治疗遗传性听力障碍方面展现了巨大的潜力，但关于AAV载体的特异性和安全性仍存在问题。耳蜗的复杂结构进一步增加了精准靶向基因递送的难度。

基于此，2025年4月21日，上海科技大学钟桂生研究团队在Neuron杂志发表了“Deciphering enhancers of hearing loss genes for efficient and targeted gene therapy of hereditary deafness”揭示了解读听力损失基因的增强子以实现高效、靶向的遗传性耳聋基因治疗。

在此研究中，作者引入了一种基于AAV报告基因的体内转录增强子重建（ARBITER）工作流程，从而实现对增强子高效解析。通过ARBITER成功证明了基因组中的保守非编码DNA元件（CNEs）协同调控Slc26a5基因的表达，并通过敲除小鼠模型进一步验证了这一发现。还通过在Slc26a5突变小鼠中进行基因治疗，评估了所鉴定增强子在治疗遗传性听力损失中的潜力。基于原有Slc26a5增强子效率有限的问题，作者设计了一个高效且特异性针对外毛细胞（OHC）的增强子B8，该增强子成功恢复了Slc26a5敲除小鼠的听力。

图一 ARBITER的概念与工作流程

ARBITER工作流程的核心概念是利用AAV-ie载体，这种载体能够高效感染多种类型的内耳细胞从而将包含合成基因调控元件的报告基因递送到耳蜗中。通过分析ATAC-seq和ChIP-seq数据集识别开放染色质序列和转录因子结合位点，并选择位于转录起始位点上下游200kb内的潜在调控元件。这些元件被插入报告基因质粒并通过AAV-ie载体递送到新生小鼠耳蜗中，注射后1-2周评估其在毛细胞和支持细胞中的特异性、效率和强度。以Atoh1基因为例，使用三个已知增强子（E1-E3）生成七个报告基因构建体，发现E2和E3组合显示出最佳的毛细胞靶向效率和特异性，而添加E1反而降低了效率。这些增强子还能在前庭毛细胞中诱导特异性表达。研究表明，ARBITER方法可靠且高效，适用于解析耳蜗基因的调控元件，为理解耳蜗发育及功能提供了新的技术手段，有助于听力损失等疾病的治疗研究。

图二 Slc26a5-E1+E2双敲除小鼠的表型特征分析

为了验证CNEs在调控基因表达中的功能，作者尝试通过敲除小鼠模型来验证所鉴定的Slc26a5增强子的功能。利用CRISPR-Cas9基因编辑技术，成功构建了Slc26a5-E1敲除小鼠（Slc26a5-E1−/−E2+/+）和Slc26a5-E1+E2双敲除小鼠（Slc26a5-E1−/−E2−/−），并对其表型进行了分析。从P6开始监测prestin的表达（此时OHCs中开始表达prestin），并通过免疫荧光染色进行检测。在Slc26a5-E1敲除小鼠模型中，P6和P16时，无论是杂合还是纯合敲除Slc26a5-E1，prestin在耳蜗顶端、中部和基底区域的表达均未受到影响。然而，在P30时，纯合敲除Slc26a5-E1的小鼠在中部和基底区域的prestin水平显著降低，而杂合敲除则导致prestin水平较野生型小鼠有中度下降。这些观察结果表明，在Slc26a5-E1缺失后，随着耳蜗成熟，prestin表达逐渐减少，尤其是在基底和中部区域。扫描电子显微镜成像显示，P30时Slc26a5-E1缺失并未影响OHC的形态。随后，在P16、P30和P90进行听觉脑干反应（ABR）和畸变产物耳声发射（DPOAE）测试表明，纯合敲除Slc26a5-E1的小鼠ABR和DPOAE阈值随成熟逐渐升高，且高频到低频的变化尤为明显，表明渐进性听力损失的发生。这些发现揭示了Slc26a5-E1在调控prestin表达中的关键作用。接下来，作者评估了Slc26a5-E1+E2双敲除小鼠中prestin的表达。纯合敲除Slc26a5-E1+E2完全消除了prestin的表达，突显了Slc26a5-E1和E2在调控prestin表达中的重要作用。P30时的SEM成像显示，纯合敲除Slc26a5-E1+E2导致显著的OHC损伤，表现为顶端、中部和基底区域明显的OHC丢失。与此一致，ABR和DPOAE测试表明，纯合敲除Slc26a5-E1+E2导致ABR阈值显著升高以及DPOAE完全消失。这些结果进一步揭示了两个增强子元件协同作用对确保目标基因稳定表达的重要性。

图三 高效且特异性针对OHC的增强子设计

体内评估显示，由更保守模块或关键模块生成的合成增强子B5（E1P3+E2P2）和B6（E1P3+E2P3）能够特异性转导OHCs。相反，由保守性较低的元件组合而成的B1（E1P1+E2P1）、B2（E1P1+E2P4）、B3（E1P2+E2P1）和B4（E1P2+E2P4）未能诱导OHC特异性的报告基因表达。更重要的是，B7（E1P3+E2P2+E2P3），即通过依次结合来自E1的一个关键模块和来自E2的两个关键模块生成的增强子，其转导效率比仅由E1P3和E2的单一关键元件组成的B5和B6更高。这些结果表明，较小的关键保守模块对于协同驱动小鼠OHC中的基因表达十分必要。基于这一模式，进一步通过复制和组合关键模块设计了两个合成增强子，分别命名为B8和B9。B8（E1P3×2+E2P2×2+E2P3×2）通过依次组合双倍E1P3、双倍E2P2和双倍E2P3生成，而B9（(E1P3+E2P2+E2P3)×2）则是通过复制B7生成，而不考虑原始Slc26a5-E1+E2的方向性。体内评估表明，B8模拟了原始E1+E2增强子的方向性，在OHC中表现出显著优于E1+E2或B7的基因表达水平。B8显示出显著提高的效率，在顶端、中部和基底区域实现了几乎100%的OHC转导。此外，B8介导的基因表达水平也显著增强。对耳蜗横截面和前庭组织的进一步成像分析证实，B8是一种高度特异性靶向外毛细胞的增强子。此外，B8并未引起大脑、心脏或肝脏的脱靶感染。作者还评估了B8在基因递送中的安全性。听觉功能测试表明，B8增强子在OHC特异性基因递送中是安全的。

图四 利用B8增强子在成年小鼠中实现OHC的安全且特异性转导

人类新生儿的内耳已完全发育，而小鼠耳蜗从新生阶段到成年阶段会经历结构和功能的变化。为评估B8增强子在潜在临床应用中的可行性，作者研究了B8在成年小鼠中OHC的转导能力。AAV报告基因在P30时被递送到耳蜗中，并在10天后进行功能和成像测试。荧光成像显示，与同时转导OHC和内毛细胞（IHC）的CAG启动子相比，B8能诱导OHC特异性的基因表达。此外，B8并未导致前庭细胞的脱靶转导。听觉脑干反应（ABR）测试表明，在16kHz下，对照组小鼠与注射AAV2-B8-nls-mNeonGreen的小鼠之间的ABR阈值相当，但注射AAV2-CAG-nls-mNeonGreen的小鼠表现出升高的阈值，这可能是由于CAG启动子介导的nls-mNeonGreen在IHC中强表达引起的毒性作用。此外，CAG而非B8介导的递送导致波I振幅降低和潜伏期延长。最后，不同频率下的ABR测试表明，对照组小鼠与注射AAV2-B8-nls-mNeonGreen的小鼠之间具有相似的阈值。这些结果表明，B8在成年小鼠中能够安全且高效地实现OHC特异性基因递送。

图五 全文摘要图

总结

该研究建立了ARBITER工作流程，用于解析听力损失基因的增强子。利用ARBITER，研究人员解码了Slc26a5基因的增强子并设计了一个高效且特异于OHC的增强子。通过基因治疗使用该增强子，成功恢复了Slc26a5基因敲除小鼠的听觉功能。

文章来源

https://doi.org/10.1016/j.neuron.2025.03.023