复方-民族药理: 甘肃中医药大学团队揭示敦煌古方大补脾汤及其活性成分缓解溃疡性结肠炎的作用机制

【写在前面】：本期推荐的是由甘肃中医药大学等研究团队合作近期发表于Journal of Ethnopharmacology(IF4.8）的一篇文章，揭示敦煌古方大补脾汤及其活性成分通过激活谷胱甘肽代谢并抑制JAK-STAT通路缓解溃疡性结肠炎的作用机制。

【期刊简介】

【题目及作者信息】

Dunhuang Dabupi Decoction and its active components alleviate ulcerativecolitis by activating glutathione metabolism and inhibiting JAK-STAT pathway in Drosophila and mice

大补脾汤（DBPD）源自敦煌医学典籍《辅行诀脏腑用药法要》，作为传承千年的经典方剂，在脾胃相关疾病的临床治疗中具有重要地位。然而，其治疗溃疡性结肠炎（UC）的分子机制尚未明晰。本研究通过构建果蝇和小鼠UC模型，系统探究DBPD治疗UC的药效机制。在果蝇模型中，通过生存分析、运动功能评估、肠道通透性检测（台盼蓝染色）、肠道形态学观察（肠道长度测量）及酸碱平衡检测等多维度评价体系，证实DBPD可显著改善DSS诱导的肠道损伤。小鼠实验采用苏木精-伊红（HE）染色和ELISA技术，揭示DBPD对结肠组织病理学损伤的修复作用及炎症因子调控效应。结合透射电镜观察、DHE超氧化物检测、免疫荧光标记、实时定量PCR及转录组测序等多组学技术，阐明DBPD通过激活谷胱甘肽代谢通路减轻氧化应激，并抑制JAK-STAT信号通路调控炎症反应的作用机制。特别通过LC-MS技术筛选鉴定了大黄酸、槲皮素、姜黄素和玉米黄素四种关键活性成分，经表型验证实验证实其具有显著改善肠道损伤的生物学效应。本研究创新性地利用果蝇+小鼠双模式生物互为佐证，揭示DBPD多靶点治疗UC的作用机制，不仅为经典方剂的现代化研究提供了创新范式，更为临床治疗难治性肠病提供了理论依据。其结论不仅有力佐证了传统医学"脾主运化"理论的科学内涵，更通过对敦煌古医方的现代科学阐释，为《辅行诀》所载验方的活态传承提供了关键实验支撑，对敦煌医学的转化应用具有重要的学术价值。

图文摘要

【前言】

溃疡性结肠炎（Ulcerative Colitis, UC）作为炎症性肠病（IBD）的重要亚型，因其复杂的多因素发病机制和迁延难愈的临床特征，被世界卫生组织列为现代难治性疾病。其典型病理特征表现为结肠黏膜持续性炎症反应，伴随氧化应激失衡和代谢紊乱，其中JAK/STAT信号通路的异常活化已被证实通过介导促炎细胞因子级联反应，导致肠道屏障功能损伤和免疫稳态失衡。当前主流治疗方案虽以氨基水杨酸制剂、糖皮质激素及免疫抑制剂为核心，但长期应用常伴随糖代谢紊乱、免疫抑制等不良反应，且存在个体疗效差异显著等问题。

近年研究发现，肠道干细胞（ISCs）功能异常与UC病理进展密切相关。当谷胱甘肽（GSH）代谢通路受损时，活性氧（ROS）清除能力下降可直接影响ISCs的增殖分化平衡，进而破坏肠上皮再生修复能力。这提示通过多靶点干预调控氧化应激-炎症级联反应可能是突破现有治疗瓶颈的新方向。在此背景下，具有"多组分-多通路"协同作用特点的天然药物成为研究热点。

敦煌医学作为传统医学体系的重要分支，其经典方剂大补脾汤（Dabupi Decoction, DBPD）在《辅行诀脏腑用药法要》中记载由人参、（炙）甘草、干姜、白术、麦冬、五味子和旋覆花以3:3:3:3:1:1:1的比例组成，现代药理学研究已证实其具有显著的抗氧化应激和胃肠保护作用。值得注意的是，该方剂在化疗性肝肾损伤防护、胃癌细胞增殖抑制等方面展现出独特优势，但其对UC的治疗潜力及作用机制尚未系统阐明。

为深入解析DBPD的干预机制，本研究创新性地构建果蝇-小鼠双模型研究体系。其中，小鼠模型因其肠道病理特征与人类高度同源，适用于长周期机制研究；而果蝇模型凭借其完备的遗传操作工具、快速繁殖特性及明确的肠道干细胞调控网络，为高通量药物筛选和分子机制解析提供独特优势。这种多模型联用策略不仅能有效克服单一模型的局限性，更能通过跨物种验证提升研究结论的可靠性。

本研究通过建立DSS诱导的肠道损伤模型，系统评估DBPD对炎症反应、氧化应激及JAK/STAT通路的关键调控作用，同时结合组学技术鉴定其活性成分群。研究结果将首次从多维度揭示敦煌古方治疗UC的科学内涵，为开发基于传统医学的新型UC治疗策略提供理论依据和实践基础。

【结果部分】

1.DBPD可以减轻DSS诱导的果蝇肠道损伤

研究发现，DBPD显著提高SDS及DSS诱导的雌雄果蝇的生存率（图1 A-D），改善UC果蝇的运动能力及排泄量（图1 E和F）。此外，DBPD还显著恢复了果蝇肠道长度（图1G)，降低了“蓝精灵”的比例（图1H)，恢复了UC果蝇的肠道酸碱稳态失衡（图1I)。因此，这些结果表明，DBPD对DSS诱导的果蝇整体生理机能和肠道损伤具有保护作用。

图1 大补脾汤修复DSS诱导的果蝇肠道损伤

2.DBPD可以抑制果蝇肠上皮细胞死亡及肠道干细胞过度增殖

利用台盼蓝试验和Myo1A-Gal4;UAS-GFP转基因果蝇研究发现，DBPD显著改善DSS诱导的果蝇肠上皮细胞的死亡程度（图2A和B）。DSS处理显著增加了esg-GAL4;UAS-GFP 转基因果蝇中GFP阳性细胞的数量，给药DBPD后，肠道中GFP阳性细胞的数量明显减少，表明DBPD抑制果蝇ISCs的过度增殖（图2C）。此外，透射电镜结果发现，补充DBPD可改善肠细胞超微结构，如核仁完整，微绒毛排列整齐。

图2 大补脾汤抑制果蝇中因DSS诱导产生的IEC死亡及ISC过度增殖

3.鉴定DBPD对DSS诱导的果蝇肠道损伤的差异基因和分子机制

主成分分析（PCA）显示Control与Model组聚类明显分离，与45mg/ml DBPD组发生聚类（图3A）。Spearman相关系数分析显示，这些结果在三组内高度一致（R≥0.98）（图3B）。模型组与DBPD相比，共筛选出差异表达基因（DEGs）数量为740个（519个上调基因，221个下调基因）（图3C）。

通过基因共表达分析。富集数量较多且差异显著的通路主要有与氨基酸代谢相关的谷胱甘肽代谢途径和与炎症反应相关的JAK-STAT信号通路等（图3D和E)。

图3 组学分析大补脾汤治疗UC的可能分子机制

4.DBPD通过激活谷胱甘肽代谢途径来减轻DSS诱导的果蝇肠道损伤

基因集富集分析（GSEA）显示DBPD可能激活谷胱甘肽代谢途径（图4A)。实验发现，DBPD显著增强GSH和GCL酶的活性（图4B和4C)。谷胱甘肽代谢途径中的关键基因，包括GCL、Trxr1（GR同源物）、GSTs和Gtpx（GPx同源物）在补充DBPD后得以恢复（图4D）。此外，作为关键抗氧化剂的GSH能有效阻断ROS介导的氧化应激损伤。研究发现DBPD可以降低果蝇肠道的ROS水平（图4E）。

图4 大补脾汤通过激活果蝇肠道谷胱甘肽代谢途径治疗UC

5.DBPD通过抑制JAK-STAT通路对DSS诱导的果蝇肠道损伤起到保护作用

JAK/STAT信号通路（Stat92E、Upd1、Upd2、Upd3）的转录结果显示，DBPD显著促进了上述基因的表达（图5A）。RT-PCR结果证实，Stat92E、Upd1、Upd2、Upd3的mRNA表达水平在补充DBPD后显著恢复。此外，利用10×STAT92E-GFP品系果蝇研究了JAK-STAT通路在果蝇肠道中的活性。结果显示 DSS处理后果蝇肠道中GFP阳性细胞数量增加，而DBPD减少了GFP阳性细胞数量（图5C）。

图5大补脾汤通过抑制JAK-STAT通路治疗UC

6.DBPD可以减轻DSS诱导的结肠炎小鼠的结肠炎症状

DBPD减轻了小鼠结肠炎进展过程中的体重减轻，并使其饮水量显著恢复（图6B和C）。降低了DAI评分（图6D）。恢复了DSS诱导的结肠缩短（图6E）。

图6 大补脾汤减轻DSS诱导肠炎小鼠的症状

7.DBPD可以改善DSS诱导的结肠炎小鼠的组织病理学改变，并恢复血清炎症水平

与DSS组相比，DBPD组的黏膜溃疡和炎症浸润显著减少，隐窝形态恢复。病理评分下降（图7A和B）。ELISA检测结果显示，DBPD显著降低了血清中促炎因子IL-1β和IL-6的水平，增加了抗炎因子IL-10的水平（图7C-E）。

图7 大补脾汤减轻小鼠因DSS诱导产生的肠道损伤及血液中炎症因子浓度

8.鉴定DBPD中抗果蝇肠道损伤的生物活性化合物

LC-MS检测和文献调研发现，DBPD中鉴定出的成分包括大黄酸、异槲皮苷、姜黄素、玉米黄质、白藜芦醇、甘草苷、人参皂苷Rg1、甜菜碱和大蒜素（图8）。

图8 LC-MS分析大补脾汤成分

保留时间结果显示，补充大黄酸、异槲皮苷、姜黄素和玉米黄质可以显著延长其中位、平均和最长存活时间（图9A-C）。此外，通过评估肠道长度、肠道通透性和肠道酸碱稳态，发现除大蒜素外，其它8种化合物均对肠道形态完整性和酸碱紊乱具有保护作用（图9D-F）。综上所述，大黄酸、异槲皮苷、姜黄素和玉米黄质这4种化合物对DSS诱导的果蝇肠道损伤表现出最显著的效果。

图9 大补脾汤中活性成分对UC的治疗效果

分子对接结果显示，大黄酸、异槲皮苷、姜黄素和玉米黄质与STAT3和GPx均具有良好的对接亲和力（图10)。

图10 大补脾汤四种活性成分与GPx和STAT3的分子对接

【结论与展望】

本研究提示DBPD通过提高生存率、运动能力和排泄量，显著减轻DSS诱导的果蝇整体机能损伤。还可以保护果蝇肠道形态损伤，修复酸碱紊乱，抑制IECs死亡和ISCs过度增殖，改善肠上皮细胞的超微结构损伤。在DSS诱导的UC小鼠中，DBPD减轻了结肠炎症状和肠道组织病理学损伤，并恢复了炎症因子的表达。根据转录组学数据，结合分子生物学实验验证，发现DBPD通过激活谷胱甘肽代谢途径显著减轻氧化损伤，通过抑制JAK-STAT通路显著减少炎症反应。此外，利用LC-MS质谱技术结合体内实验验证，大黄酸、异槲皮苷、姜黄素和玉米黄质是DBPD抗UC的主要生物活性成分。因此，上述结果DBPD可能是一种很有前途的UC预防和治疗的潜在策略。为敦煌古医方的推广应用和临床用药提供了理论和实验证据。

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