Cell | 构建首个人工胞外呼吸系统——大肠杆菌依赖胞外电极生长

撰文 |Sure

生命的维持依赖于电子的流动，细胞通过电子传递产生能量，驱动自身新陈代谢过程【1】。这种电子流必须进入电子槽（electron sinks），完成电子传递后才能释放能量并维持生命活动【2】。传统观点认为电子传递只发生在细胞内部，例如大肠杆菌在有氧或无氧条件下通过细胞内部的电子受体进行呼吸，以获得生存所需的能量【3,4】。然而，一类胞外产电菌Exoelectrogens的发现打破了这种认知。Exoelectrogens能够将代谢产生的电子转移到细胞外的环境中，比如还原外界的金属氧化物，这种特殊的电子传递机制被称为胞外电子传递（extracellular electron transfer,EET）【5,6】。越来越多的研究表明，EET在自然环境和生态系统中非常关键，甚至在人类肠道微生物群落的能量代谢中也可能发挥重要作用。此外，这种电子传递还可连接电子元件与活细胞，未来可能被用于控制细胞的能量代谢、调控基因表达以及改变细胞整体的生理状态。

大肠杆菌传统意义上并非胞外产电菌，但是由于大肠杆菌被广泛的应用于研究，有科学家尝试通过基因工程手段引入胞外电子传递功能到大肠杆菌中，但是这些人工改造的效果有限。有趣的是，有研究发现如果在厌氧条件下将大肠杆菌放置在外部的电极环境中长时间培养，菌株可以自然进化出强大的胞外电子传递能力，这种能力甚至可以媲美天然的胞外产电菌【7】。这种自然进化的大肠杆菌是通过分泌一种特殊的小分子化合物2-羟基-1,4-萘醌（HNQ）介导胞外电子传递，实现胞外呼吸【8-10】。这意味着大肠杆菌其实具备一种潜在的天然胞外产电代谢方式，这种方式能够在缺氧环境中帮助其获得能量。然而，对于具体的HNQ介导的胞外电子传递机制并不清楚。

近日，来自美国莱斯大学的Caroline M. Ajo-Franklin与合作者在Cell上发表了论文Extracellular respiration is a latent energy metabolism in Escherichia coli。在本研究中，作者探究了HNQ在大肠杆菌中介导EET的具体机制，展示了E. coli 能够适应并重塑自身代谢，进化出以阳极为呼吸终端的生存方式。这些发现为生物电子器件、生物传感器、合成生物碳固定等提供了坚实的基础。

研究人员猜测，HNQ可以作为电子穿梭体，将大肠杆菌代谢中产生的电子从细胞内部带出去，最终传递给外部电极。这个过程依赖于细胞对碳源（如甘油、葡萄糖）的代谢氧化，因为这才是电子的来源。他们发现，加入HNQ后，大肠杆菌在无生长条件下也能迅速产电，说明细胞代谢正在释放电子，而HNQ在搬运它们。删除细胞代谢甘油的关键基因后，HNQ介导的产电能力显著下降，再补回部分基因后又恢复，说明碳源氧化是HNQ驱动EET的前提。

谁HNQ的电子供体？——细胞内的“还原者”

NADH是代谢过程的主要电子载体，在呼吸或发酵中被氧化用以维持细胞的NAD⁺/NADH平衡，研究人员推测HNQ可能是NADH传递电子的新途径。作者敲除多个NADH消耗路径，发现呼吸链还原酶、NADH脱氢酶的删除不仅未影响EET产电，反而使其产电更多，说明这两条路径与HNQ是竞争关系，负责抢走电子而不是给HNQ传递电子。当乳酸、乙醇等发酵产物形成通路被敲除后，HNQ产电水平大增，表明发酵路径的缺失导致电子优先流向HNQ。系统筛选细胞内还原酶，作者发现两个关键酶——NfsA和NfsB，是最有效的HNQ还原酶。这两种酶来源于硝基还原酶家族，通常负责异物解毒。这些发现表明，NADH/NADPH 是主要电子来源，NfsA/B 是驱动HNQ还原的关键酶。

在厌氧生长条件下，HNQ介导的的EET能支持细胞增长吗？

在没有氧气时，大肠杆菌通常会走发酵通路，把NADH的电子转移给一些中间代谢产物，维持能量代谢运转。如果把这些电子不再交给传统发酵产物，而是交给胞外的HNQ，再通过HNQ转移到阳极，是不是也能让NADH变回NAD⁺，维持代谢？为了验证这种可能性，作者构建了一种完全失去所有传统NAD+再生路径的FermNull菌株，删除与发酵产物形成通路相关的关键酶后，在正常情况下这样的菌株是不能生长的，因为NADH在细胞里堆积。作者在FermNull菌株中添加HNQ作为电子穿梭载体，同时表达了可还原HNQ的酶，在无氧条件下进行培养。令人惊奇的是，FermNull 菌株在这些条件下不仅能产电，还恢复了细胞生长，并且产电水平随着时间逐步增强，说明细胞代谢逐渐适应这种新型胞外呼吸模式。模拟预测显示，在HNQ介导EET的帮助下，细胞再生了NAD⁺，避免NADH堆积，还引导碳流走向更高效的能量释放路径（乙酸化 + ATP生成）。

通过适应性进化，获得FN0、FN1高性能产电菌株

最初，FermNull菌株虽然能在加入HNQ和还原酶的条件下维持一定产电和少量生长，但并不高效。然而， FermNull 的产电水平在培养到第39小时后突然明显升高，细胞的生长量（OD600）也显著上升，说明EET能力与细胞生长发生了耦合。FermNull 在HNQ和电极构成的压力条件下，产生了代谢适应，并获得了更高效的胞外电子传递能力。将适应性菌株重复接种后，获得FN1菌株，该菌株已经形成稳定的遗传，可以在培养初期就能表现出非常强的产电能力。通过比对原始FermNull菌株与进化后的菌株基因组，作者发现了一个稳定存在的突变，这个突变在外膜孔蛋白ompC基因上。研究发现，进化后菌株的代谢适应性与该基因上的突变直接相关，该蛋白成为调控胞外电子传递效率的代谢门控因子。

E. coli 可完全依赖阳极作为电子槽维持厌氧生长

在细胞代谢过程中，营养物被“氧化”，释放出电子，但这些电子必须有去处，在有氧时氧气是最常见的电子槽，而无氧时发酵产物充当电子槽，此外还有一些呼吸链中间体也可以发挥这种作用。

文章的最后，作者设计了一个非常严苛的实验条件，在进化得到的高性能EET菌株 FN1 的基础上，研究者又删除了所有可用的还原性碳代谢路径和氢气生成路径，也就是说没有乳酸、乙醇、甲酸、丙二醇等发酵产物、没有氢气释放也没有传统呼吸链中的内源性电子受体，只提供外接电极作为唯一的电子槽，该菌株被命名为AnodeSole。作者将AnodeSole放入生物电化学系统中培养，研究发现AnodeSole菌株可以稳定地产生电流，且细胞生长明显，代谢活跃。这表明，在没有任何传统电子汇的条件下，大肠杆菌依赖人工电子穿梭体（HNQ）+ 电极完成能量生成和细胞生长。这意味着，大肠杆菌的能量代谢边界被彻底打破；电极可以成为真正意义上的代谢出口； 我们可以人为地重定向电子流，重编微生物代谢通路，构成一个完全替代自然发酵系统的人工呼吸机制。

https://doi.org/10.1016/j.cell.2025.03.016

制版人： 十一

参考文献

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