《食品科学》：哈尔滨商业大学关桦楠教授等：荧光碳量子点模拟酶比色-荧光双传感体系检测葡萄糖

在当今快速发展的食品工业中，葡萄糖作为一种重要的能量来源和食品成分，在食品生产和加工中占据着举足轻重的位置。传统的葡萄糖检测方法如高效液相色谱法等不适用于现场快速检测。

纳米酶是一种人工合成的纳米材料，具有类似天然酶的催化活性。优异的催化性能和生物相容性使得纳米酶成为构建生物传感器和检测平台的理想候选材料。荧光碳量子点（CQDs）作为一种新型的纳米材料因其具有良好的光学性能和生物相容性以及易于合成等特点，在环境监测、食品安全、生物成像和药物输送等领域受到了广泛关注。

哈尔滨商业大学食品工程学院的关桦楠、张明一、王丹丹等人采用食品废弃物（玉米芯）通过一步水热法绿色制备荧光CQDs，利用玉米芯荧光碳量子点（CFCD）过氧化物模拟酶活性及荧光特性构建一套针对葡萄糖的检测体系。该体系中葡萄糖氧化酶（GOx）与葡萄糖发生反应产生H2O2，利用CFCD的模拟酶特性催化H2O2与2,2’-联氮双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)（ABTS）反应，形成绿色的氧化态ABTS（ox-ABTS），此外，CFCD模拟酶还可以催化H2O2产生羟自由基（·OH），CFCD模拟酶的荧光特性会被羟自由基猝灭，检测机制如图1所示。本研究旨在实现对体系中葡萄糖浓度的间接测量，为葡萄糖检测技术的发展提供一种新思路。

1 CFCD的表征

如图2A所示，CFCD纳米粒子具有突出的纳米结构，呈球形颗粒，粒径约为3 nm且无聚集现象。图2B显示在324 nm波长处CFCD具有明显的紫外吸收峰，这归因于C＝C中的π→π*和C＝O中的n→π*跃迁，由此可推断出所制备的CFCD具有表面态捕获激发态能量的特性。图2C显示CFCD在475 nm波长处出现一个明显的荧光吸收峰，这可能是含芳香环、杂环的化合物可以发出荧光所致。进一步观察发现，含氧官能团的取代导致p共轭程度升高，从而使荧光强度增加。如图2D所示，1 492 cm-1处的吸收峰为C＝C伸缩振动特征吸收峰，2 917 cm-1处的吸收峰对应于C—H的特征吸收峰，3 327 cm-1处的吸收峰对应于O—H的特征吸收峰。这表明所制备的CFCD纳米粒子表面含有羟基、羧基等亲水基团，具有良好的亲水性和生物相容性。

利用XPS 仪分析CFCD 所含特征元素。XPS 全谱图分析结果表明，CFCD主要由C（285 eV）和O（532 eV）2种元素组成（图3A）。由C1s高分辨谱显示，CFCD主要含有C＝C（284.39 eV）和C—O（285.85 eV）2种官能团（图3B）；O1s高分辨谱显示的两个峰可归结于C—OH（531.65 eV）和C—O（532.78 eV）官能团（图3C）。

2 CFCD模拟酶活性验证及稳态动力学分析

如图4所示，CFCD-H2O2体系、CFCD-ABTS体系、H2O2-ABTS体系均未观察到特征吸收峰或颜色变化，说明体系中没有任何氧化还原反应发生。只有当CFCD、H2O2和ABTS共同存在的情况下，才能观察到反应溶液发生反应变成绿色（曲线D），在420 nm波长处CFCDH2O2-ABTS体系具有明显的紫外吸收峰，该峰是因为CFCD氧化ABTS为ABTS阳离子自由基，从而促进了H2O2氧化还原生成羟自由基，羟自由基经历电子转移以缓解ABTS的氧化。综上所述，只有在CFCD、H2O2和ABTS同时存在时，CFCD才能模拟过氧化物酶的活性，催化H2O2产生大量的羟自由基，导致ABTS发生颜色变化。因此，说明该荧光CQDs具有过氧化物酶活性。

由图5A、B可知，当底物为ABTS且浓度固定时，随着H 2 O 2 浓度增加，反应初速度先迅速增加后逐渐平缓直至稳定；当底物为H 2 O 2 且浓度固定时，随着ABTS浓度增加，反应初速度的上升趋势逐渐平缓。结果表明，当ABTS浓度在0.1～7.5 mmol/L范围内，反应初速度与ABTS的浓度之间符合典型的米氏方程。将催化反应初速度倒数作为纵坐标，将底物浓度倒数作为横坐标，构建双倒数曲线图。如图5C、D所示，对双倒数曲线作线性拟合，可得出良好的正相关线性关系。通过双倒数曲线的斜率和截距计算CFCD的催化动力学常数。以ABTS为底物时，

K

V

K

V

3 紫外-可见光比色法检测体系优化

3.1模拟酶检测葡萄糖体系单因素试验结果

CFCD纳米材料在类过氧化物酶催化方面的表现受到反应温度、反应时间和纳米材料添加量的影响。在不同温度、反应时间和CFCD添加量条件下进行一系列实验，以评估它们对催化效果的影响。如图6A所示，随着温度从30 ℃升高到70 ℃，所制备的模拟酶材料催化性能逐渐增强。这可能是因为高温能够提高模拟酶的催化效率，加速反应速率，导致吸光度的增加。因此，选择50、60、70 ℃作为正交设计优化试验的温度条件。

为了进一步优化CFCD模拟酶的催化活性，对底物的反应时间进行调整。如图6B所示，在相同条件下，将反应时间延长至20 min时，CFCD持续催化H2O2释放羟自由基，进一步氧化ABTS，导致反应程度加剧，ABTS阳离子自由基累积增多，吸光度持续增加。然而，当时间延长至25 min时，吸光度的变化趋于缓慢。这是因为随着反应时间的延长，CFCD模拟酶催化产生羟自由基的量达到了最大值，此后催化效果虽略有下降，但吸光度仍然较高。因此，选择15、20、25 min作为正交设计优化试验的反应时间。

如图6C所示，当CFCD添加量从100 μL增加至200 μL时，CFCD过氧化物模拟酶的性能逐渐增强，吸光度持续增加。这表明CFCD添加量的增加有助于提高酶的催化性能，产生大量具有强氧化活性的物质（羟自由基）。然而，当添加量从200 μL增加至300 μL时，模拟酶的催化性能开始下降，吸光度急剧减小。这可能是因为GOx催化葡萄糖产生的H 2 O 2 几乎被消耗殆尽，导致反应的吸光度变化不大。因此，选择150、200、250 μL作为正交设计优化试验的CFCD添加量。

3.2模拟酶检测葡萄糖体系正交试验优化

如表2所示，通过正交试验分析，实验各因素对反应体系的影响程度排序为反应温度＞反应时间＞CFCD添加量。结果表明，最优检测条件为反应温度70 ℃、反应时间20 min、CFCD添加量为200 μL（即 A 3 B 2 C 2 ）。根据以上分析可知，反应温度是影响模拟酶催化体系的主要因素。通过对10 mmol/L葡萄糖标准溶液进行3 次独立平行实验，得到吸光度约为0.848，相对标准偏差为0.33%，这说明该模拟酶催化葡萄糖检测系统具有良好的精密度。

4 荧光法检测体系优化

4.1模拟酶检测葡萄糖体系单因素试验结果

如图7A所示，在30～60 ℃范围内，随着反应温度的升高，荧光强度差值逐渐增大，这表明温度升高有利于提高检测体系的效果；在60～70 ℃时荧光强度差值随温度的升高而下降。这可能是因为GOx催化反应需要氧气的参与，而反应温度改变导致反应体系中氧气浓度发生变化，进而影响酶活性。随着温度升高，反应体系中氧气的溶解度下降，导致葡萄糖的催化氧化反应不完全，产生的H2O2减少。鉴于过高的反应温度不利于实时检测，因此选择50、60、70 ℃参与正交设计优化试验。

如图7B所示，在5～10 min内，随着水浴时间的延长，体系的荧光强度差值增大。这是因为CFCD模拟酶在反应过程中释放活性需要一定时间，并且在5～10 min范围内，反应时间越长酶活性越强。然而，在10～25 min时，随着水浴时间的延长体系的荧光强度差值急剧下降，这是因为随时间的延长GOx的活性降低。结果表明，反应时间为10 min时催化体系反应效果基本达到最优，过长的反应时间会影响葡萄糖反应体系。因此，选择5、10、15 min作为正交设计优化试验的反应时间。

如图7C所示，CFCD的添加量对体系的催化效果有显著影响。当CFCD添加量在100～200 μL范围内，CFCD过氧化物模拟酶性能随添加量的增加而增强，荧光强度差值持续增大。在这个范围内，酶催化性能与添加量呈正比，因为CFCD催化H 2 O 2 产生大量的羟自由基。然而，当添加量从200 μL增加到300 μL时，体系的荧光强度差值急剧下降。这可能是因为在分子氧存在下，GOx能氧化葡萄糖生成 D -葡萄糖酸内酯，同时消耗氧生成H 2 O 2 。当H 2 O 2 几乎被消耗完时，CFCD持续增加对荧光强度的变化影响不大。因此，选择150、200、250 μL作为正交设计优化试验的CFCD添加量。

4.2模拟酶检测葡萄糖体系正交试验优化

如表3所示，通过正交试验分析，实验各因素对反应体系的影响大小排序为反应温度＞反应时间＞CFCD添加量。结果表明，最优检测条件为反应温度50 ℃、反应时间10 min、CFCD添加量200 μL（即 A 1 B 2 C 2 ）。根据以上分析可知，反应温度是影响模拟酶催化体系的主要因素，而CFCD添加量和反应时间对体系的影响较小。按照最优方案对10 mmol/L葡萄糖标准溶液进行3 次独立平行实验，得到荧光强度差值约为5 818.571，相对标准偏差为0.47%，这说明该模拟酶催化葡萄糖检测系统具有良好的精密度。

5 比色-荧光双传感检测葡萄糖体系的工作曲线及检出限

利用紫外-可见光比色法在最优条件下检测了不同浓度的葡萄糖。如图8所示，在0.001～0.5 mmol/L范围内，吸光度与葡萄糖浓度呈现出良好的线性关系，工作曲线回归方程为 y ＝10.907 x ＋0.659 5（ R 2 ＝0.993 8），检出限为1.305 5 μmol/L。在相同检测体系下，分别检测0.005、0.01、0.05 mmol/L葡萄糖标准液的吸光度。利用标准曲线回归方程对该比色检测体系进行回收率评价，结果显示回收率分别为100.47%、96.28%和103.06%，相对标准偏差均小于5%。这表明该比色生物传感器具有高准确度和稳定性。

利用荧光法在最优条件下检测了不同浓度的葡萄糖。如图9 所示，随着葡萄糖浓度升高，体系荧光强度增大，荧光强度差随之增加。葡萄糖浓度在0.001～0.1 mmol/L范围内具有良好的线性关系。工作曲线方程为

y

R

表4总结了基于CFCD比色-荧光双传感体系检测葡萄糖的方法与其他CQDs检测葡萄糖的已报道方法对比。相较于其他检测方法，本研究所构建的葡萄糖检测方法具有相对较低的检出限，突显了基于CFCD比色-荧光双传感体系的高灵敏度。本研究中方法结合比色法的直观性和荧光法的高灵敏度，使其在检出限方面表现出了显著优势，且荧光法具有更低的检出限和更高的灵敏度，这使得基于CFCD的方法在检测葡萄糖方面更具竞争力。

6 检测体系选择性分析

如图10A所示，这些干扰物质的浓度是葡萄糖的100 倍，但只有在反应体系中加入葡萄糖标准溶液时才会产生较强的吸光度响应。这表明只有葡萄糖发生了特异性氧化，产生了H 2 O 2 ，随后被CFCD催化与ABTS反应，使溶液显绿色。如图10B所示，只有葡萄糖标准溶液能够与氧化酶发生反应产生H 2 O 2 ，CFCD与其反应产生羟自由基，猝灭自身荧光，从而形成荧光强度的差值。通过对比，说明该双传感检测方法对葡萄糖具有较强的选择性。

7 实际样品检测

在最优条件下，对含有不同浓度葡萄糖的水蜜桃、白葡萄、雪碧和脉动溶液样品进行吸光度和荧光强度差值的检测，并将结果代入工作曲线回归方程，评估其加标回收率。由于水蜜桃和白葡萄果肉中同时存在其他糖类物质（如Fru和甘露糖），对GOx具有竞争抑制作用，导致葡萄糖氧化程度的降低和H 2 O 2 浓度的减小，因此葡萄糖的检测效果也变弱。雪碧和脉动溶液的甜味剂为白砂糖，是非还原性糖，加入氢氧化钠溶液后会转化为葡萄糖和Fru，从而可以测定其中葡萄糖的含量。如表5所示，该双传感检测系统具有良好的加标回收率。进行3 次重复测定后，相对标准偏差均小于4%，表明比色-荧光双传感检测系统具有良好的加标回收率和精密度，因此具有实际样品检测的应用潜力。

结论

基于GOx作用于葡萄糖反应产生H2O2的特性，利用CFCD模拟酶催化反应底物H2O2与ABTS产生显色反应，同时利用CFCD模拟酶活性以及可被羟自由基猝灭荧光的性质，构建了一种比色-荧光双传感检测葡萄糖的体系。在紫外-可见光比色法最优条件下，葡萄糖在0.001～0.5 mmol/L范围内具有良好的线性关系，检出限为1.305 5 μmol/L。在荧光法检测体系最优条件下，葡萄糖在0.001～0.1 mmol/L范围内具有良好的线性关系，检出限为9.249 7 nmol/L。根据工作曲线回归方程，该比色-荧光双传感体系的回收率分别为96.28%～103.06%和96.31%～103.19%，表明该体系对共存分子表现出优异的抗干扰能力。相较而言，荧光法检测方法具有更低的检出限和更高的灵敏度，因此更适用于实际样品中微量物质成分的检测。

作者简介

第一作者：

关桦楠，教授，江苏科技大大学粮食学院粮油食品实验中心主任，博士研究生导师，江苏科技大学-粮油食品安全与营养团队学科带头人。现为教育部学位论文质量监测评审专家，中国粮油学会青年委员，教育部高等学校科学研究发展中心专家库成员，中国食品报社、中国食品学院联盟专家委员会委员，黑龙江省环境产业协会理事，黑龙江省环境产业专家库专家，黑龙江省食品科学技术学会青年委员，《Frontiers in Chemistry》等期刊客座编辑，《食品科学技术学报》等多家高水平中文核心期刊编委或青年编委，《Food Chemistry》等30余种SCI收录期刊的特约审稿人。主要从事农产品成分检测分析及粮油食品加工催化的相关研究。先后获得黑龙江省科学技术奖2 项，黑龙江省科技进步奖1 项，梁希林业科学技术奖2 项；主持及参与完成课题31 项，其中，主持国家级课题3 项，省部级课题5 项；发表学术论文132 篇，以第一作者或单独通信作者身份，在国内外高水平学术期刊上发表学术论文88 篇，其中，SCI期刊收录论文38 篇（1 篇为ESI高频次引用论文），EI期刊收录论文21 篇；授权专利18 项。作为主编撰写全英文专著1 本，副主编撰写国家高等学校规划教材1 本，参编国家“十二五”规划教材1 本，国家“十三五”规划教材1 本。

本文《荧光碳量子点模拟酶比色-荧光双传感体系检测葡萄糖》来源于《食品科学》2024年45卷第24期232-241页，作者：关桦楠，张明一，王丹丹，张朱泽惠。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20240428-262。点击下方阅读原文即可查看文章相关信息。

实习编辑：王雨婷 ；责任编辑：张睿梅。点击下方阅读原文即可查看全文。图片来源于文章原文及摄图网。

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