Nat Chem Biol | 张楹团队建立了一种可捕捉DNA拓扑结构引起的脱靶编辑新方法

随着越来越多CRISPR基因编辑工具进入临床实验，检测脱靶编辑对于安全至关重要。已有的检测方法主要集中在向导RNA（gRNA）与基因组序列之间的错配，忽略了细胞内基因组DNA天然存在的复杂三维拓扑结构对脱靶编辑的影响。

2025年4月2日，武汉大学医学研究院张楹团队在Nature Chemical Biology发表了题为TOPO-seq reveals DNA topology-induced off-target activity by Cas9 and base editors的研究文章。研究团队前期发现DNA拓扑结构不仅调控Cas9识别PAM的特异性，也影响编辑效率（Mol Cell, 2022）。为了进一步探究拓扑结构是否影响脱靶编辑，研究者建立了一种可以捕捉拓扑结构引起的全基因组脱靶编辑的新方法（TOPO-seq）。利用TOPO-Seq在多个临床gRNA和治疗相关细胞中，检测出大量由于拓扑结构所引起的脱靶位点。进一步分析发现，这些拓扑结构所引起的脱靶含有更多的错配序列，且呈现细胞特异性。这一发现提示了必需在治疗相关的细胞中进行全面的脱靶检测，以确保治疗效果和安全性。基因编辑治疗具有不可逆的特性，一旦编辑产生，就无法逆转。如果脱靶编辑发生在癌基因附近，很可能导致基因疗法临床试验的失败。建立的TOPO-seq方法不仅能够灵敏地检测基因编辑工具在不同DNA拓扑构象中的脱靶风险，还能够评估临床相关细胞中的脱靶情况，为基因编辑工具的安全性和临床转化提供了可靠的技术支持。

CRISPR/Cas9基因编辑技术及其衍生的碱基编辑工具在基础研究和临床治疗中展现出巨大潜力。为了全面评估这些工具在全基因组范围内的脱靶活性，并排除可能引发致癌突变的临床前gRNA，开发精准且高灵敏度的脱靶检测技术显得尤为关键。

目前，大多数脱靶检测方法主要聚焦于gRNA与目标DNA序列之间的配对，仅从一维序列角度出发，忽略了DNA在细胞内复杂的三维拓扑结构。在生理条件下，DNA分子通常以右手双螺旋结构（B-DNA）存在，在此基础上， DNA双链进一步弯曲、缠绕形成的复杂三维空间结构称为DNA拓扑结构。其中，超螺旋是DNA拓扑结构的核心特征。B-DNA进一步向左螺旋或向右螺旋可以形成紧密缠绕（overwinding）的正超螺旋或松弛缠绕（underwinding）的负超螺旋。在真核细胞内，基因组DNA通常以负超螺旋形式存在，由拓扑异构酶动态调控，维持基因组DNA的拓扑稳态。在DNA转录、复制过程中，局部DNA双链被打开，导致其下游区域过度缠绕，形成正超螺旋结构以克服双链打开所产生的扭力；反之，上游DNA呈现负超螺旋结构。研究者前期发现DNA拓扑结构可以调控Cas9识别靶标序列的特异性（Mol Cell, 2022），然而拓扑结构是否影响Cas9的全基因组脱靶活力还未知。

为了研究这个问题，研究者开发了TOPO-seq方法，用于检测拓扑结构对基因编辑脱靶效应的影响。该方法由两步构成（图1）。第一步，检测体外脱靶位点。将基因组随机打断并构建环化文库。通过在环化过程中加入不同浓度的溴化乙锭（Ethidium bromide，EB）制备出不同负超螺旋密度的环状DNA文库，以模拟细胞内多变的拓扑状态。进而，将不同拓扑结构的环状DNA文库分别与基因编辑工具进行体外编辑，通过测序鉴定脱靶编辑位点。第二步，在治疗相关的细胞内，利用多重PCR验证真实脱靶位点（图1）。

图1 TOPO-seq检测示意图

利用TOPO-seq, 研究者在多种细胞内成功检测出大量由DNA拓扑结构变化引起的脱靶编辑位点。当应用于检测治疗β-血红蛋白病的三个临床gRNAs，通过电转在造血干细胞瞬时递送三种编辑器Cas9、ABE8e和hyA3A-BE4max，仍可检测出拓扑敏感性脱靶位点。且在细胞移植16周的小鼠骨髓中仍然检测出多个脱靶位点，其中脱靶效率最高达37.39%。这一结果证实了 TOPO-seq在全基因组范围内脱靶检测的高灵敏度和可靠性，以及基因编辑工具安全性评估的重要性。

进一步机制研究表明，细胞内DNA拓扑结构的改变可直接影响Cas9的脱靶活性。当直接改变多个目标序列的局部拓扑结构，使其位于松散构象时，可以显著提高脱靶编辑效率至2.78% ~ 98.69%。分析脱靶位点特征发现，当DNA处于松散缠绕状态时，Cas9对脱靶位点的容错性显著提高，许多被忽略的含有5-6个错配碱基的位点也被有效测出，并且更高的负超螺旋程度会提高Cas9对靠近PAM第6 bp – 14 bp处的碱基错配耐受度。本研究还比较了三种编辑器的脱靶效应，发现相较于核酸酶Cas9, 碱基编辑器呈现更高的脱靶活性，在部分含5至6个错配的位点，碱基编辑的脱靶效率可高达87.7%。

总之，TOPO-seq 揭示了 DNA 拓扑结构对 Cas9 及碱基编辑器脱靶活性的显著影响，且可检测出传统方法（GUIDE-seq和Digenome-seq）遗漏的高风险位点，检测灵敏度更高，为基因编辑技术的安全性评估提供了新视角和新工具。研究强调了，在基因编辑工具的临床前评估中，需充分考虑 DNA 拓扑结构对脱靶效应的潜在影响，针对特定细胞类型进行脱靶评估，以确保临床应用的安全性。

武汉大学博士后段敏、博士生高盼和张逸舟为共同第一作者。武汉大学张楹教授为通讯作者。本研究获得武汉大学化学与分子科学学院郭存兰教授、医学研究院殷昊教授和武汉大学医学研究院仪器设备共享中心的帮助。

https://www.nature.com/articles/s41589-025-01867-7

制版人： 十一

学术合作组织

（*排名不分先后）

战略合作伙伴

（*排名不分先后）

（*排名不分先后）

转载须知

【非原创文章】本文著作权归文章作者所有，欢迎个人转发分享，未经作者的允许禁止转载，作者拥有所有法定权利，违者必究。

BioArt

Med

Plants

人才招聘

会议资讯

近期直播推荐