中药1区: 南京中医药大学揭示土茯苓通过激活Nrf2/HO-1信号减轻顺铂诱发的小鼠急性肾损伤

【写在前面】：本期推荐的是由南京中医药大学中医学院、南京中医药大学药学院、南京中医药大学医学院等研究团队近期发表于Phytomedicine(IF=6.7）的一篇文章，揭示土茯苓通过激活Nrf2/HO-1信号减轻顺铂诱发的小鼠急性肾损伤。

顺铂（CDDP）因其显著的疗效被广泛应用于临床癌症化疗中，但其严重的肾毒性常导致急性肾损伤（AKI），进而影响患者的治疗和生活质量。土茯苓（Smilax glabra Roxb，TFL）是一种中药材，具有多种药理作用，包括抗肿瘤、抗炎和抗氧化活性，其中抗氧化活性对重金属毒性的解毒非常有用。

本研究旨在通过探讨土茯苓在缓解 CDDP 诱导的 AKI 方面的肾保护作用，阐明其潜在机制。在体内模型中，第7天腹腔注射CDDP（20毫克/千克）诱导AKI。从第1天开始，每天按1.95和3.9克/千克的剂量给予TFL治疗，连续10天。在注射 CDDP 72 小时后的第 10 天采集血液样本进行分析。使用血红素和伊红（HE）染色观察肾脏病理变化，并使用透射电子显微镜评估线粒体的超微结构。使用 Western 印迹、PCR 和免疫荧光法（IF）测定了核因子红细胞 2 相关因子 2（Nrf2）、HO-1、NQO1、caspase-3 和细胞色素 C（CYT-C）的表达水平。使用相应的试剂盒测定了三磷酸腺苷（ATP）水平、线粒体膜电位（MMP）和活性氧（ROS）。经 40 μM CDDP 诱导后，HK2 细胞出现明显的线粒体损伤，Nrf2、HO-1 和 NQO1 的蛋白和 mRNA 表达受到抑制，但在 TFL 处理后逐渐增加。CDDP诱导的小鼠AKI与体外HK2细胞模型的观察结果相似。

在体内和体外实验中，TFL激活了Nrf2/HO-1信号通路，促进了抗氧化酶的表达，从而改善了CDDP诱导的氧化应激、线粒体功能障碍和肾细胞凋亡。

研究结果

一、TFL 化学成分的特征

图1 正离子和负离子模式下的 TFL 总离子流图

• 采用 UPLC-MS/MS 对 S. glabra 水提取物进行表征，显示正离子和负离子模式下的代表性总离子色谱图。

• 使用 UPLC-MS/MS 鉴定 TFL 中的化学成分，在水萃取物中共鉴定出 20 种成分，主要包括 astilbin , isoastilbin , 和 neoastilbin 等化合物。
  

二、TFL 对 CDDP 诱导的小鼠模型和 HK2 细胞 AKI 的保护作用

图2 TFL 对 AKI 小鼠和 HK2 细胞的保护作用

• 建立 AKI 小鼠模型，小鼠在第7天腹腔注射20毫克/千克剂量的CDDP诱导AKI，然后用1.95和3.9克/千克剂量的TFL治疗。在小鼠模型中，对照组的肾脏呈紫红色，而 CDDP 组的肾脏则明显苍白。经 TFL 治疗后，肾脏形态得到了不同程度的部分恢复，这表明TFL 对 CDDP 引起的 AKI 有保护作用。

• 体重监测和生化分析证实，TFL 能有效缓解 CDDP 引起的体重下降和肾功能指标（即 BUN 和 SCR）的异常升高。CDDP组也出现了明显的核固缩和坏死，在TFL治疗后逐渐恢复。利用CCK-8测定法确定了CDDP在体外的IC50浓度，IC50为40 μM。根据这一浓度，选择 0.25 和 0.5 mg/ml 的 TFL 剂量进行进一步实验。
  

三、TFL 对 CDDP 诱导的线粒体损伤的保护作用

图3 TFL 对 HK2 细胞线粒体的保护作用

图4 TFL 对 AKI 小鼠线粒体的保护作用

• 线粒体在 CDDP 诱导的肾损伤中起关键作用，透射电子显微镜显示，CDDP 组的线粒体损伤相当严重，包括肿胀、膜破裂和嵴解体，而TFL 处理可使线粒体形态逐渐恢复。在功能上，CDDP 导致 ATP 水平显著下降、ROS 增加和 MMP 减少，而 TFL 则有效地改善了这些情况。TFL 处理可减轻线粒体膜破裂引起的细胞色素 C（Cyt-C）泄漏，TFL 处理组中裂解的 Caspase-3 和 Cyt-C 的表达减少。

• 这些结果表明，TFL 可通过保护线粒体功能来防止 CDDP 诱导的线粒体损伤。
  

四、TFL通过Nrf2/HO-1途径减轻CDDP诱导的氧化应激损伤

图5 TFL 可激活 HK2 细胞中的 Nrf2/HO-1 通路

图6 TFL 可激活 AKI 小鼠的 Nrf2/HO-1 通路

• CDDP诱导的线粒体损伤伴随着氧化应激的增加，氧化应激的增加会加剧AKI。与对照组相比，CDDP诱导的HK2细胞的Nrf2、HO-1和NQO1的蛋白和mRNA表达量显著下降。用 TFL 处理后，这些表达水平恢复。IF 染色进一步证实了 CDDP 组 Nrf2 和 HO-1 表达的下降，而 TFL 处理后，Nrf2 和 HO-1 的表达明显升高。

• 在CDDP诱导的小鼠体内，Nrf2和HO-1的表达大大降低，而所有治疗组都得到了恢复。

• 这些研究结果表明，TFL 可通过 Nrf2/HO-1 通路保护肾细胞免受氧化应激。
  

五、ML385 介导的逆转效应证实了 TFL 的细胞保护机制

图7 ML385 的反向验证效果

图8 ML385 的反向验证效果

• 使用 Nrf2 抑制剂 ML385 进行反向验证实验，ML385有效逆转了TFL诱导的Nrf2表达上调，并大大降低了其对HK2细胞的保护作用。透射电子显微镜和线粒体功能检测显示，在 ML385 的干预下，CDDP+ML385 组和 CDDP+ML385+TFL 组的线粒体 ATP 含量和膜电位有一定程度的恢复，但并未完全恢复到对照组的水平。ROS 水平大大低于 CDDP 组，表明ML385 部分逆转了 TFL 对线粒体的保护作用。这些发现进一步表明 Nrf2/HO-1 通路在 TFL 保护作用中的关键作用。
  

研究结论

该研究表明，TFL 不仅能有效抑制 CDDP 诱导的氧化应激和细胞凋亡，而且能特异性靶向线粒体功能，与其他草药化合物相比具有独特的优势。通过增强 Nrf2/HO-1 通路和恢复线粒体完整性，TFL 能够作为治疗化疗诱导的 AKI 的有效方案。未来的研究应在更复杂的模型中探索 TFL 的药理作用，并评估其与其他抗癌药物联用的临床安全性和有效性。

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