《食品科学》：齐齐哈尔大学林巍副教授等：玉米肽对酒精损伤PC12细胞的保护作用及机制

玉米肽由于其独特的氨基酸组成而具有良好的醒酒护肝脑作用，国内外众多学者对玉米肽醒酒护肝机制在动物和细胞分子水平已经开展了一系列的研究，但玉米肽对受损神经系统的修复作用以及对酒精性脑损伤的细胞保护机制还缺乏相应的研究，因此从乙醇中毒机制出发，开发找到阻断相应靶点缓解乙醇神经毒性的天然、无毒、营养的活性肽类食品是目前学者们关注和研究的热点。

齐齐哈尔大学食品与生物工程学院的林巍、韩思琪、刘晓兰等从氧化应激、炎症相关、神经营养因子、突触可塑性相关蛋白等方面在细胞水平上初步探讨了玉米肽对酒精损伤神经细胞的保护作用及机制，以期为研制出具有神经保护活性的活性肽类食品提供一定的参考依据。

01

PC12细胞酒精损伤模型的建立

1.1 乙醇对细胞PC12存活率的影响

设立了终浓度为300、400、500、600 mmol/L的含乙醇培养基培养24 h，以筛选出酒精损伤细胞的最佳条件。如图1所示，与对照组相比，4 种含有不同浓度乙醇的培养基中细胞存活率随着乙醇浓度的不断升高而逐渐降低，与乙醇浓度呈反比关系。当乙醇浓度为300 mmol/L时，细胞的存活率为（81.04±2.22）%，细胞的受损程度较轻，细胞形态变化不明显；当乙醇浓度为400 mmol/L时，细胞的存活率为（68.06±3.86）%，与对照组相比具有显著差异（

P

＜ 0.05 ），此时细胞损伤程度适中，部分细胞神经突起回缩，贴壁效果一般；乙醇浓度为 500 mmol/L 时，存活率为（ 56.80 ± 2.64 ） % ，受损细胞数量明显上升，细胞形态发生较大改变，大部分细胞漂浮在培养基中；而当乙醇浓度为 600 mmol/L 时，存活率为（ 26.87 ± 1.80 ） % ，细胞贴壁性极差，细胞开始大范 围死亡，不适宜用于模型的建立。

1.2乙醇对细胞PC12细胞形态及细胞核的影响

由图2A可知，在光学显微镜下观察到，对照组中PC12细胞排列分布规则，生长状态良好，细胞之间连接紧密且细胞数目较多；与对照组相比，模型组中细胞的形态发生了较为明显的变化，可见细胞与细胞之间缝隙变大，神经突起回缩，细胞贴壁性较差且有脱落现象，部分细胞胞体变小，形态固缩，细胞膜完整性丧失甚至出现破裂，有部分细胞碎片，表明乙醇作用使细胞形态发生了显著变化，导致细胞严重损伤。采用Hoechst33258染色法观察到的乙醇对细胞核形态的影响见图2B，正常对照组中PC12细胞的形态完整，蓝色荧光均匀呈现于细胞核内，与对照组相比，模型组（400 mmol/L）中PC12细胞中发出亮蓝色荧光的细胞数量明显增多，部分细胞出现不同程度的核固缩变形或破裂，表明乙醇对PC12细胞具有损伤作用，导致细胞存活率下降。核萎缩和染色质浓缩是神经元细胞死亡途径的主要事件，也被认为是神经元退化的早期标志。以上结果表明400 mmol/L乙醇对PC12细胞具有显著影响，结合存活率，选择400 mmol/L为酒精损伤最适浓度，并以此建立酒精损伤模型开展后续实验。

02

玉米肽对酒精损伤PC12细胞的保护作用

利用前期建立的PC12酒精性损伤模型，研究玉米肽对酒精损伤PC12细胞的保护作用。从图3可以看出，与对照组相比，酒精损伤模型组细胞损伤严重，细胞存活率为（64.46±1.82）%，显著降低（

P

＜ 0.05 ），而预先加入玉米肽处理的细胞，细胞存活率均显著高于酒精模型组（

P

＜ 0.05 ）。在玉米肽质量浓度较低（ 25 μg /mL ）时，细胞存活率显著上升至（ 68.59 ± 1.82 ） % ，即对酒精损伤 PC12 细胞表现出显著的保护效果（

P

＜ 0.05 ），且随着质量浓度的升高，玉米肽对 PC12 细胞存活率的影响越加明显，这表明玉米肽对乙醇诱导损伤的 PC12 细胞具有保护作用，并具有剂量依赖性。从中选取量效关系较好的 3 个玉米肽质量浓度（ 25 、 100 、 400 μg /mL ）进行后续实验，进一步 探讨玉米肽对酒精损伤神经细胞的保护机制。

03

玉米肽对酒精损伤细胞氧化应激相关指标的影响

3.1 玉米肽对酒精损伤细胞中GSH浓度的影响

从图4可以发现，与对照组相比，酒精损伤模型组细胞内GSH水平显著降低（

P

＜ 0.05 ）。玉米肽预处理细胞后再用乙醇诱导细胞损伤，在实验质量浓度范围下，细胞内 GSH 水平呈上升趋势，表明玉米肽对乙醇诱导氧化损伤的细胞内 GSH 水平下降表现出了积极的调节作用。该实验结果与前期小鼠实验结果一致，无论是动物实验还是细胞实验，玉米肽皆可提高神经细胞中 GSH 的浓度。这种调节作用在其他细胞中也被证实，Wang Liying等研究了玉米肽对人肝癌细胞内GSH和活性氧水平的调控作用，结果表明玉米肽可以提高H2O2诱导损伤细胞的抗氧化能力及GSH水平，推测玉米肽这种作用与其自身具备较好的抗氧化活性密不可分。

3.2玉米肽对酒精损伤细胞中MDA浓度的影响

从图5可以看出，与对照组相比，模型组PC12细胞内MDA浓度升高了87%，与对照组差异显著（

P

＜ 0.05 ），表明乙醇诱导细胞损伤时，促进了细胞中脂质过氧化物 MDA 的生成。与酒精损伤模型组相比，玉米肽 25 、 100 、 400 μg /mL 剂量组中 MDA 浓度均显著减少（

P

＜ 0.05 ），具有一定的剂效关系，其中 400 μg /mL 剂量组效果最好， MDA 浓度下降了 34.56% ，这表明玉米肽能降低酒精损伤 PC12 细胞内的 MDA 生成量，抑制细胞的过氧化，本实验室前期动物实验也表明玉米肽能够降低大鼠酒后脑组织细胞中 MDA 的浓度。

3.3玉米肽对酒精损伤细胞中SOD质量浓度的影响

从图6可知，与对照组相比，模型组PC12细胞中SOD质量浓度显著下降（

P

＜ 0.05 ）。模型组 PC12 细胞中 SOD 质量浓度相较于对照组下降了 45.29% ，表明乙醇可使细胞内 SOD 质量浓度降低，导致活性下降。乙醇处理后，脂质过氧化物的大量生成，从而抑制了 SOD 活性。而预先加入不同玉米肽处理后的细胞内 SOD 质量浓度均显著高于模型组（

P

＜ 0.05 ），表明玉米肽能够缓解酒精损伤导致的细胞内的 SOD 水平下降。有报道发现玉米肽可以提高体外酒精损伤肝细胞模型细胞内SOD活力。因此玉米肽对细胞内的SOD活性具有调节作用。

04

玉米肽对酒精损伤细胞炎症反应相关指标的影响

4.1玉米肽对酒精损伤细胞中TNF-α质量浓度的影响

如图7所示，与对照组相比，模型组细胞内TNF-α质量浓度显著升高（

P

＜ 0.05 ），表明乙醇促进了细胞中 TNF- α 合成或分泌。与酒精损伤模型组相比，玉米肽 25 、 100 、 400 μg /mL 剂量组 PC12 细胞中 TNF- α 质量浓度均显著减少（

P

＜ 0.05 ），且呈量效关系，其中 400 μg /mL 剂量组效果最好。实验结果表明，玉米肽预处理能显著降低酒精损伤 PC12 细胞中 TNF- α 水平，减少炎症反应发生，缓解 乙醇对神经细胞的损伤。

4.2玉米肽对酒精损伤细胞中IL-6质量浓度的影响

从图8可以看出，与对照组相比，酒精损伤模型组PC12细胞内IL-6质量浓度显著升高（

P

＜ 0.05 ），表明乙醇诱导细胞损伤提高了 IL-6 水平。与酒精损伤模型组相比，玉米肽 25 、 100 、 400 μg /mL 剂量组中 IL-6 质量浓度均显著减少（

P

＜ 0.05 ），表明玉米肽可以降低酒精损伤细 胞中炎性因子含量，缓解乙醇对细胞的损伤。

4.3玉米肽对酒精损伤细胞中NF-κB质量浓度的影响

玉米肽对酒精诱导PC12细胞损伤条件下细胞内NF-κB水平调节作用结果如图9所示。与对照组相比，酒精损伤模型细胞内NF-κB质量浓度显著升高（

P

＜ 0.05 ），表明乙醇诱导细胞损伤时促进了 NF- κ B 合成。与模型组相比，玉米肽质量浓度为 25 μg /mL 时细胞中 NF- κ B 质量浓度降低，但不显著（

P

＞ 0.05 ），玉米肽 100 、 400 μg /mL 剂量组中 NF- κ B 质量浓度均显著减少（

P

＜ 0.05 ），其中 400 μg /mL 剂量组效果最好，但仍未恢复到正常对照组水平，玉米肽对酒精损伤神经细胞内 NF- κ B 质量浓度的升高具有抑制作用。

05

玉米肽对酒精损伤细胞中神经营养因子的影响

5.1玉米肽对酒精损伤细胞中NGF质量浓度的影响

从图10可以发现，与对照组相比，乙醇作用后的PC12细胞内NGF水平显著降低（

P

＜ 0.05 ）。玉米肽预处理细胞后再用乙醇诱导细胞损伤，在实验质量浓度范围内，细胞内 NGF 水平均有所提高，接近对照组细胞内 NGF 水平，表明玉米活性肽预处理能够提高酒精损伤 PC12 细胞中 NGF 质量浓度。

5.2玉米肽对酒精损伤细胞中BDFNF质量浓度的影响

从图11可以看出，与对照组相比，乙醇作用PC12细胞后，模型组细胞内BDNF水平显著降低（

P

＜ 0.05 ）。与模型组相比，玉米肽预处理后细胞内 BDNF 水平随着玉米肽剂量增加显著上升（

P

＜ 0.05 ），表明玉米肽可以增加受损细胞内的 BDNF 质 量浓度，修复受损神经细胞，保护酒精损伤的神经细胞。

06

玉米肽对酒精损伤细胞中突触可塑性相关蛋白的影响

6.1玉米肽对酒精损伤细胞中SYN水平的影响

从图12可以看出，与对照组相比，模型组细胞中突触素（SYN）质量浓度下降了20.77%，与对照组差异显著（

P

＜0.05），表明乙醇诱导细胞损伤降低了SYN水平。乙醇诱导PC12细胞损伤后，细胞代谢反应速率减缓，神经递质转运能力降低，使SYN水平下降。但使用玉米肽预处理后，在实验范围内，乙醇诱导损伤的细胞中SYN质量浓度未见显著改善 。但本实验未发现玉米肽对酒精损伤细胞中SYN水平的改善作用，表明其改善酒精性脑损伤的功能可能并不是通过提高细胞内SYN水平实现的。

6.2玉米肽对酒精损伤细胞中psd-95水平的影响

由图13 可知，与对照组相比，模型组细胞中PSD-95水平显著降低（

P

＜0.05）。玉米肽预处理细胞后再用乙醇诱导细胞损伤，发现在实验质量浓度范围下细胞内PSD-95水平呈上升趋势，其中25 μ g /m L玉米肽组细胞中PSD-95水平变化不显著（

P

＞0.05），100 μg/mL和400 μg/mL玉米肽组显著升高（

P

＜0.05），但未恢复至正常水平。这表明玉米肽预处理的方式能够增加酒精损伤PC12细胞内PSD-95的质量浓度，提示玉米肽可能通过上调PSD-95水平，参与突触可塑性的调节，维持突触信号传递这个重要过程，从而改善学习记忆功能。

6.3玉米肽对酒精损伤细胞中GAP-43水平的影响

从图14可以看出，与对照组相比，当仅有乙醇作用PC12细胞时，细胞内GAP-43水平显著降低（

P

＜ 0.05 ），表明乙醇可降低神经细胞中 GAP-43 含量，损伤神经细胞的功能。玉米肽预处理细胞后再用乙醇诱导细胞损伤，在实验质量浓度范围下，细胞内 GAP-43 水平呈上升趋势，与模型组相比，各玉米肽组均显著提高（

P

＜ 0.05 ），其中 400 μg /mL 玉米肽效果最好，可使 GAP-43 恢复至对照组水平。表明玉米肽预处理的方式能够提高酒精损伤细胞内 GAP-43 含量，促进 PC12 细胞神经功能恢复，增强突触可塑性。推测玉米肽对酒后神经细胞的保护作用可能与 GAP-43 蛋白含量恢复有关。

07

为了进一步明确玉米肽对脑组织及神经细胞的保护作用，本研究在细胞水平上继续探讨了玉米肽对酒精损伤PC12细胞的保护作用及可能机制。PC12细胞是大鼠肾上腺髓质嗜铬瘤分化细胞株，具有神经内分泌细胞的一般特征，常被应用于研究脑损伤、神经元分化等相关神经系统疾病的模型，在结构和功能上与神经元有很多相似之处。结果显示，在蛋白质量浓度为25～400 μg/mL范围内，分子质量＜1 kDa的玉米肽可提高酒精损伤PC12细胞的存活率，并具有剂量依赖性。

本研究结果表明玉米肽可提高酒精损伤PC12细胞中GSH和SOD含量、抑制MDA的生成。这些结果提示玉米肽通过自身的较强的抗氧化活性抑制脂质过氧化，从而缓解乙醇导致的SOD活性下降，增加细胞的抗氧化能力，减轻自由基的对神经细胞的损伤作用。

本研究结果发现玉米肽可降低酒精损伤PC12细胞中炎症因子TNF-α和IL-6的水平，抑制乙醇导致的NF-κB含量升高。NF-κB参与调节炎症反应时，可与多种炎症因子相互促进激活，导致组织过度炎症反应及损伤[28]。玉米肽可能通过抑制NF-κB表达，从而降低多种炎症因子的生成，也可能是通过抑制多种炎性因子的含量，从而调控NF-κB的合成，减轻细胞的炎症反应，确切机制需要进一步的探讨。

本研究结果显示，与正常对照组相比，酒精损伤模型组PC12细胞中NGF和BDNF含量显著降低。BDNF是参与大多数形式的突触可塑性的关键神经营养因子，支持神经元的生长、生存、分化等。研究表明乙醇应激会导致神经细胞中BDNF表达和信号传导的下降，影响突触可塑性[31]。本研究中，乙醇作用后，PC12细胞中PSD-95、SYN和GAP-433 种突触可塑性相关蛋白含量显著降低。而玉米肽预处理能够提高酒精损伤PC12细胞中NGF和BDNF含量，还可上调突触可塑性相关蛋白PSD-95和GAP-43的含量，但对乙醇引起的SYN含量降低没有调节作用。除此之外NGF还可以增加SOD在细胞内的含量，因此玉米肽对细胞中NGF含量的调节作用不但加快了神经细胞的修复，也可改善细胞内的氧化应激状态。上述结果提示具有复杂结构的天然活性肽可能通过多靶点、多通路改善乙醇对神经细胞的损伤作用，这也与酒精损伤机体细胞的复杂机制相对应。

结论

玉米肽可以显著改善乙醇导致的PC12细胞损伤，其主要作用机制是通过提高细胞抗氧化能力和减轻细胞的炎症反应，从而降低乙醇对PC12细胞的损伤作用，同时还通过提高神经营养因子和突触可塑性相关蛋白的水平，促进受损细胞的恢复和维持突触可塑性，这将为研制出具有神经保护活性的活性肽类食品奠定理论基础。

作者简介

第一作者：

林巍，副教授，齐齐哈尔大学食品与生物工程学院教师，毕业于东北农业大学基础兽医专业，研究方向为食品中大分子生物学活性研究，主要是以细胞和动物模型评价各种生物大分子的生物学活性，如蛋白及肽类的免疫、醒酒、健脑、抗肿瘤等功能性作用及机制的研究。

本文《玉米肽对酒精损伤PC12细胞的保护作用及机制》来源于《食品科学》2024年45卷第21期194-202页，作者：林 巍，韩思琪，刘晓兰，许英一。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20240410-085。点击下方阅读原文即可查看文章相关信息。

实习编辑：南伊；责任编辑：张睿梅。点击下方阅读原文即可查看全文。图片来源于文章原文及摄图网

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