上海
【导读】人类疾病的多效应和基因相互作用网络的复杂性要求基因敲入小鼠能够进行多重基因扰乱。
2025年3月20日，耶鲁大学/约翰霍普金斯医院的研究团队在期刊《Nature Biomedical Engineering》上发表了题为“Cas12a-knock-in mice for multiplexed genome editing, disease modelling and immune-cell engineering”的研究论文。
https://www.nature.com/articles/s41551-025-01371-2
在这项研究中，团队描述了一系列以C57BL/6为背景、在Rosa26基因座上插入条件性或组成性表达LbCas12a或高保真增强AsCas12a的基因敲入小鼠。团队还介绍了一种同时进行双基因激活和基因敲除（DAKO）的系统。
Cas12a基因敲入小鼠以及病毒和非病毒载体为基因组编辑、疾病建模和免疫细胞工程的体内外应用，以及复杂基因相互作用的解构提供了一个多功能工具包。
01
研究背景
Cas12a的Lb变体（LbCas12a）可同时或依次扰乱癌细胞系中的多个基因。LbCas12a酶与腺相关病毒（AAV）载体一起被用于将嵌合抗原受体有效敲入人类原代T细胞的基因组位点，同时敲除假定的检查点抑制剂。经证实，AsCas12a的工程化版本enAsCas12a（取代E174R/S542R/K548R）及其高保真版本enAsCas12a-HF1（取代E174R/N282A/S542R/K548R）扩大了PAM序列并提高了多重基因编辑效率。因此，开发具有稳定Cas12a基因敲入的小鼠品系有望实现高效的体内外多重基因组工程，尤其是在小鼠原代细胞中。
02
利用LSL-enAsCas12a-HF1小鼠开发同步DAKO系统
流式细胞术分析表明，sgItgb4-crCD24-Cre DAKO靶向导致CD24 SKO的细胞群蛋白减少量与SKO对照组（crCD24-Cre）相当。与单基因CRISPRa靶向对照相比，sgItgb4-crCD24-Cre DAKO也导致了细胞群体水平的ITGB4蛋白上调。DAKO组ITGB4上调较高可能是由于CD24和ITGB4之间潜在的相互作用。与sgItgb4-Cre和crCD24-Cre对照组的背景水平相比，只有在DAKO组中研究人员观察到了相当高水平的预期双靶向细胞群，其基因调控方向正确。这些结果表明，DAKO系统可以在单细胞水平实现高效、同步的基因激活和敲除，从而在免疫细胞中实现正交双基因靶向。
与LSL-enAsCas12a-HF1；dCas9-SPH双转基因小鼠同时进行DAKO。
03
总结
1. 组成型和条件性Cas12a小鼠菌株可高效实现体内和离体多重基因组工程，适用于多种应用领域；
2. 与Cas9小鼠相比，这些小鼠编辑效率相当，且具有基于crRNA阵列的多重基因编辑独特优势，可促进体内治疗性基因靶向、疾病/肿瘤建模和原代免疫细胞工程的快速无缝工作流程；
3. 研究结果可用于高通量CRISPR筛选研究复杂遗传问题，如免疫细胞中效应子和记忆表型转换，以及不同肿瘤类型或复杂基因型肿瘤模型的本土肿瘤建模；
4. 组成型Cas12a菌株中不同器官Cas12a表达水平不同，混合CRISPR筛选时需考虑目标组织中Cas12a表达水平，建议使用组织/细胞类型特异性Cre驱动因子驱动Cas12a表达；
5. 研究结果有望产生具有其他变体的Cas12a小鼠及不同安全港基因座敲入的小鼠，推动Cas12a基因编辑工具包在不同领域的广泛应用。
参考资料：
1.Wang, J. Y. & Doudna, J. A. CRISPR technology: a decade of genome editing is only the beginning. Science 379, eadd8643 (2023).
2.Abudayyeh, O. O. et al. C2c2 is a single-component programmable RNA-guided RNA-targeting CRISPR effector. Science 353, aaf5573 (2016).
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