Adv Sci丨NOP56基因内含子中的非经典反平行“椅式”G-四链体结构

G-四链体 （G-quadruplex） 是由富含鸟嘌呤的核酸序列折叠形成的非经典结构，在多种生物过程尤其是基因调控中发挥重要作用。研究发现MYC、EGFR、KRAS、c-KIT、VEGF和PDGFR-β等多个癌相关基因的启动子区均存在G-四链体序列，通过小分子配体稳定这些基因中的G-四链体结构可抑制基因表达，这使得G-四链体成为疾病治疗的新型药物靶点。核仁蛋白56 （nucleolar protein 56, NOP56） 是C/D盒小核仁核糖核蛋白复合体的关键组成，在核糖体生物合成中发挥重要功能。研究发现NOP56在多种癌症中高表达，包括结肠腺癌、食管癌、肺腺癌和KRAS突变型癌症等。NOP56的高表达与KRAS突变型癌症的低生存率相关，而敲低NOP56可显著增强KRAS突变型癌细胞的死亡。这些发现使NOP56成为癌症治疗的重要靶点。然而，目前尚无直接靶向NOP56蛋白的配体和抑制剂，因此亟需开发调控NOP56基因的新策略。

中国科学院杭州医学研究所韩达研究员/郭沛副研究员团队报道了NOP56基因1号内含子中的GGGCCT重复序列形成G-四链体结构 （NOP56-G4） ，通过液体核磁共振波谱测定了其高分辨率三维结构，揭示了其反平行“椅式”的拓扑特征；进一步发现小分子PDS结合并稳定NOP56-G4，并通过解析NOP56-G4-PDS复合物三维结构阐明了结合机制；最后证明了PDS能够降低癌细胞中NOP56 mRNA水平。研究结果揭示了NOP56基因形成特殊的G-四链体结构，证明了靶向内含子区G-四链体结构以调控基表达的可行性，为靶向核酸结构的药物开发提供了关键基础和新思路。该工作以Structural Insights into an Antiparallel Chair-Type G-Quadruplex From the Intron of NOP56 Oncogene为题发表在Advanced Science上。

基因组分析显示NOP56基因1号内含子区存在一段GGGCCT DNA重复序列。我们选取21-nt的5′-GGGCCTGGGCCTGGGCCTGGG-3′序列进行研究，利用一维核磁氢谱发现其形成G-四链体结构 （命名为NOP56-G4） ，并通过优化溶液条件获得了单一的G-四链体构象。NOP56-G4的圆二色谱图表明其形成反平行G-四链体结构。我们利用1H-1H NOESY和1H-15N HSQC二维核磁谱图对NOP56-G4的1H信号进行了归属，并通过核苷酸间H1-H8 NOEs确定了G2·G21·G14·G9和G3·G8·G15·G20两个G-四分体的形成以及方向。更有趣的是，基于C4-G7和C16-G19之间H41/H42-H1 NOEs以及其低场的H41/H42信号，我们发现NOP56-G4结构中包含了一个特殊的C4·G7·C16·G19四分体。

我们从二维核磁谱图中提取结构约束参数，通过约束型分子动力学模拟测定了NOP56-G4的高分辨率结构。在NOP56-G4中，G2·G21·G14·G9和G3·G8·G15·G20四分体相互堆积，后者与C4·G7·C16·G19四分体进一步堆积。在C4·G7·C16·G19四分体中，除了Watson-Crick碱基对之外，C4和C16的H42还分别与G19 O6/N7、G7 O6/N7形成双重氢键。另外，C5和C17形成配对并堆积在C4·G7·C16·G19四分体上，这对NOP56-G4的稳定性至关重要。值得一提的是，C5·C17错配的形成也使得NOP56-G4具有pH响应性，这在G-四链体结构中较为少见。

既往研究关注的G-四链体多位于癌相关基因的启动子，而内含子区域G-四链体的形成与功能鲜有探索。基于NOP56-G4的发现，我们进一步探究内含子区的NOP56-G4是否可以作为小分子配体的靶点以抑制NOP56基因表达。PDS是一种强效的G-四链体配体，常被用作概念验证。利用核磁共振波谱和圆二色谱实验，我们发现PDS结合NOP56-G4并将NOP56-G4的熔解温度 （Tm） 提高了~14 °C。为理解PDS对该特殊G-四链体结构的识别机制，我们测定了NOP56-G4-PDS复合物的三维结构。结果显示PDS的吡啶环堆积在G14/G21上，其中一个喹啉基团则堆叠于 G2 和 G9 之间。除堆积作用外，PDS 与 G1、G2、G9、G14 的碱基之间，以及 与 G2、C11、T12、G13 的磷酸骨架之间形成多对静电作用。

最后，我们尝试以PDS稳定NOP56-G4结构来抑制NOP56基因的转录。使用PDS处理Hela、A431和A549三种癌细胞系，并通过实时定量聚合酶链式反应实验对NOP56 mRNA水平进行测定。对于Hela和A549细胞，10 µM的PDS处理显著降低了NOP56 mRNA的水平；在A431细胞中，较低剂量 （5 µM） 的PDS即可显著降低NOP56 mRNA水平。这些结果证明靶向内含子区域的G-四链体可作为调控基因表达的手段。

图. PDS显著下调癌细胞中NOP56 mRNA水平

本工作首次报道了NOP56基因1号内含子中的非经典反平行“椅式”G-四链体结构，阐明了NOP56-G4与小分子配体结合的识别机制，为靶向核酸结构的药物设计提供了重要基础和新思路。此外，我们证明了PDS对NOP56-G4的结合能够降低NOP56 mRNA水平，表明内含子G-四链体可作为靶点来调控基因表达，扩展了G-四链体的生物学意义。

第一作者：严珍珍、何阿信、万里祺 通讯作者：韩达研究员、郭沛副研究员

文章链接：https://advanced.onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1002/advs.202406230

制版人：十一

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