江苏
组织细胞RNA提取是分子生物学研究中最常见的一类实验，但很多同学特别是刚进实验室的研究生，做这个实验时，仍会遇到这样或那样的问题。针对该实验中的一些常见问题，我们整理了一份清单和解决方案，供大家借鉴参考。
1、组织/细胞样本如何进行前处理？
组织/细胞样本的前处理非常重要，处理不当则会影响RNA提取效果：
l组织样本：取说明书建议量的组织，用液氮研磨为粉末后进行RNA提取（或直接在生理盐水中将组织匀浆为细胞悬液）；
l细胞样本：a.贴壁细胞，需先用胰酶消化，处理为细胞悬液，离心去上清，再加入生理盐水振荡至细胞悬浮；b.悬浮细胞，离心去上清，再加入生理盐水振荡至细胞悬浮。
2、RNA得率低怎么办？
评价RNA得率是否低时，研究者首先需对样本本身能够提取的RNA量有正确的预估，因为不同细胞或组织中的RNA丰度是不同的，如肝脏，胰腺，心脏等是高丰度组织(总RNA含量2-4μg/mg)，脑，胚胎，肾脏，肺，胸腺，卵巢等是中丰度组织(总RNA含量0.05-2μg/mg)，膀胱，骨，脂肪等是低丰度组织(总RNA含量<0.05μg/mg)；
其次，再从提取层面上考虑改进：
① 确保组织/细胞量在试剂盒规定范围内。超过此范围会导致样本无法充分裂解，影响RNA释放；样本量过少则直接影响提取的RNA总量；同时，研究者也要注意样本和试剂的搭配比例问题。
② 选择裂解能力强的裂解液。组织/细胞样本是否被充分裂解将直接影响RNA的提取得率，尤其是一些难以裂解、核酸含量本来就少的样本，如部分脂肪含量较高的组织、纤维组织等等，这些样本如果不能被充分裂解，其中的RNA便很难被释放出来，对于RNA含量本来就低的样本更是如此，因此需要选择具备充分裂解能力的裂解液。建议选择市面上在核酸提取领域深耕多年，技术可靠的生物试剂厂家，如Qiagen、Starvio等品牌，均拥有专利的裂解液配方，能够帮助充分彻底的裂解各种组织、细胞样本，有效提高RNA产量。
③ 选择吸附能力强的核酸吸附膜。核酸吸附膜的关键作用是吸附游离形态的核酸，其吸附能力越强，得到的RNA产量就越高。普通国产吸附膜较厚，吸附能力一般，Starvio使用的是进口离子膜，做到吸附膜更薄的同时吸附能力更强，有助于提高RNA得率。
3、如何提升RNA纯度？
Ø使用消化能力强的复合消化液。组织/细胞样本中往往含有大量的蛋白质，释放出的RNA也会被蛋白所包裹，可以选择具备多重消化技术的复合消化液来处理这类蛋白污染。
Ø选择去污能力强的洗涤液。组织/细胞样本中的蛋白污染被消化只是第一步，想要彻底去除，还需要通过洗涤液的洗涤作用，建议选择Starvio的高效去污洗涤液，其中含有高效去污因子，洗涤掉蛋白的同时，也可将色素、脂质等污染一并去除。
Ø避免次生污染。在RNA提取过程中，环境中或仪器上附着的DNA、蛋白质、多糖和有机化合物等污染物可能会影响RNA的纯度，研究者需保持实验室操作的严谨性，使用专门用于RNA提取实验的器皿，避免与DNA样本、试剂或器皿的交叉污染。
4、RNA降解会有哪些原因？
1）提取的样本不新鲜或新鲜组织取出后没有马上处理或冷冻；
2）处理样品的量太大；
3）待提取RNA的样本没有保存于-70℃至-80℃，而保存在了-5℃至-20℃；
4）细胞在用胰酶处理时过度；
5）枪头或离心管未经RNase去除处理；
6）电泳时使用的甲醛PH值低于3.5。
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