Mol Cell | COMET技术揭示E3泛素连接酶与底物的相互作用

撰文 | 格格

细胞需要精确地控制蛋白质水平以维持其稳态并响应环境变化【1】。蛋白质降解是这一过程的关键机制，它通过将泛素标记到蛋白质上并随后将其降解来实现。泛素-蛋白酶体系统 （UPS） 是执行这一任务的细胞机器，其中E3泛素连接酶扮演着至关重要的角色【2】。E3泛素连接酶负责选择性地将泛素添加到特定底物蛋白上，从而启动其降解过程。目前已知的E3泛素连接酶种类繁多，超过600种【3】。然而，大多数E3泛素连接酶的底物蛋白仍然未知，这限制了我们对UPS在细胞内功能的理解。虽然已有一些方法用于识别 E3 泛素连接酶的底物，例如全局蛋白质稳定性 （GPS） 分析，但这些方法存在局限性。GPS分析依赖于广泛抑制UPS功能的单一扰动，例如表达主导性负性CUL1片段或药物抑制蛋白酶体途径。这种单一扰动缺乏特异性，无法确定单个CUL1亚基对底物降解的贡献。此外，由于E3泛素连接酶和潜在底物数量庞大，GPS分析的规模也受到限制。

近日，来自美国华盛顿大学分子和细胞生物学系的Jay Shendure和Chase C. Suiter研究团队在Molecular Cell杂志发表题为Combinatorial mapping of E3 ubiquitin ligases to their target substrates的研究论文，该研究开发了一种名为COMET的组合筛选方法，用于大规模识别蛋白酶体E3泛素连接酶与其靶蛋白之间的相互作用。

首先研究人员开发了一种名为COMET的方法。为了验证COMET方法的有效性，研究人员首先将其应用于SCF泛素连接酶，该酶介导靶蛋白的降解。他们构建了一个包含6716个 F-box蛋白与潜在靶蛋白ORF组合的COMET库，并使用CRISPR-Cas9技术将库整合到 HEK293-rtTA-Cas9或K562-rtTA-Cas9细胞中。通过比较每个ORF在含有非靶向gRNA和靶向gRNA的细胞池中的平均丰度，研究人员可以确定哪些E3泛素连接酶的敲除会影响特定靶蛋白的丰度。结果发现，许多E3-靶蛋白组合的蛋白质丰度指数（PSI） 显著增加，表明E3泛素连接酶的敲除稳定了这些靶蛋白。

为了进一步验证COMET方法的普适性，研究人员将其应用于降解寿命短的转录因子。他们构建了一个包含83,484个gRNA-ORF组合的 COMET 库，靶向241个编码CRL家族和 APC/C泛素连接酶亚基的基因，并将其整合到K562-Cas9-rtTA细胞中。同样地，研究人员发现，与 SCF 实验类似，许多E3-靶蛋白组合的PSI显著增加，表明E3泛素连接酶的敲除稳定了这些靶蛋白。

为了进一步理解E3-靶蛋白相互作用的特征，研究人员将所有实验中识别的E3-靶蛋白组合进行了分类。他们排除了涉及核心E3 蛋白成分的组合，并仅考虑显著稳定组合。结果表明，E3-靶蛋白相互作用可以分为四种类型：一对一、多对一、一对多和多对多。例如，FBXW7 蛋白调节了18个靶蛋白，包括 TP53，而TP53本身也受单个连接酶的调节，因此 FBXW7 与TP53之间的相互作用被归类为多对一。尽管研究人员并未测试所有E3蛋白与所有潜在靶蛋白之间的相互作用，但这些结果表明COMET方法可以揭示蛋白酶体调节网络的连接性。

为了验证COMET方法识别的E3-靶蛋白相互作用的可靠性，研究人员利用 AlphaFold-Multimer进行了计算机模拟。他们选择了103个显著稳定的COMET-靶蛋白组合，以及1000个来自COMET实验的非显著E3-靶蛋白组合作为对照组。此外，他们还选择了 1000个随机选择的蛋白质对作为随机对照，以及1000个来自BioPlex数据库的E3-蛋白质对作为阳性对照。通过计算每个模型的预测质量指标，研究人员发现COMET-靶蛋白组合与 BioPlex组合具有相似的置信度和一致性，并且显著高于随机对照和真实随机对照。这表明 AlphaFold-Multimer可以作为实验筛选的补充手段，为 E3-靶蛋白相互作用提供可靠的支持。

为了进一步研究AlphaFold-Multimer预测的E3-靶蛋白相互作用的特征，研究人员对一些显著稳定的组合进行了更详细的分析。他们使用AlphaFold对PTTG1、SOX12、CDKN1A和 APBB1IP蛋白进行了结构建模，并与其相应的E3 泛素连接酶共折叠。结果表明，共折叠可以增加与潜在降解结构域 （degron） 相对应的区域的模型置信度。例如，PTTG1蛋白的 KEN-box和 D-box模式在共折叠后具有更高的置信度，而SOX12蛋白的潜在降解结构域也与其转录激活结构域重叠。这些结果表明，AlphaFold-Multimer可以帮助识别 E3-靶蛋白相互作用中的潜在降解结构域。

图1 COMET技术揭示E3泛素连接酶与底物相互作用

总之，该研究开发了COMET，一种大规模识别蛋白酶体E3泛素连接酶与靶蛋白相互作用的组合实验框架，并发现了许多复杂的E3-靶蛋白关系和具有结构基础的相互作用。这项研究为理解蛋白酶体调节网络提供了新的见解，并为开发针对特定蛋白降解的疗法提供了新的靶点。

https://doi.org/10.1016/j.molcel.2025.01.016

制版人：十一

参考文献

1. King, R.W., Deshaies, R.J., Peters, J.M., and Kirschner, M.W. (1996). How proteolysis drives the cell cycle.Science274, 1652–1659.

2. Berndsen, C.E., and Wolberger, C. (2014). New insights into ubiquitin E3 ligase mechanism.Nat. Struct. Mol. Biol.21, 301–307.

3. Deshaies, R.J., and Joazeiro, C.A.P. (2009). RING domain E3 ubiquitin ligases.Annu. Rev. Biochem.78, 399–434.

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