中药单体1区高分思路分享 | 大蒜素通过增强PKC-δ介导线粒体自噬减轻创伤性脑损伤引起的神经炎症

【写在前面】：本期推荐的是由江南大学医学中心、南京医科大学第一附属医院联合发表于Phytomedicine(IF=6.7）的一篇文章，揭示大蒜素通过增强PKC-δ介导的线粒体自噬减轻创伤性脑损伤引起的神经炎症。

【期刊简介】

【题目及作者信息】

Allicin alleviates traumatic brain injury-induced neuroinflammation by enhancing PKC-δ-mediated mitophagy

【摘要】

背景：创伤性脑损伤（TBI）会导致神经炎症，这是TBI患者预后不良的关键因素。近期研究表明，大蒜素可以预防TBI后的神经元损伤。然而，大蒜素是否通过促进线粒体自噬来缓解神经炎症尚不清楚。

目的：我们研究了大蒜素对神经炎症的抑制作用，并阐明了线粒体自噬在其中的作用机制。

研究方法：采用控制性皮质撞击（CCI）方法有效模拟活体系统中的TBI。通过Bv2细胞拉伸模型在体外模拟细胞机械损伤。通过评估TNF-α、IL-1β、IL-6、ROS、IL-4和IL-10的水平以及NLRP3和TLR4蛋白的表达来评估神经炎症。通过RNA测序和KEGG分析揭示大蒜素在Bv2细胞拉伸模型中调控的分子过程。通过免疫荧光染色标记自噬标志蛋白LC3和线粒体外膜（OMM）标志物COX IV。通过脂质质谱（MS）和脂质组学分析测定OMM和线粒体内膜（IMM）中的心磷脂（CL）水平。通过透射电子显微镜（TEM）观察线粒体的双层结构。通过Western blot检测PKC-δ的表达和PLS3的磷酸化水平。将拉伸后的Bv2细胞与原代神经元共培养，以评估大蒜素的抗神经炎症作用。通过行为实验（如转棒实验和Morris水迷宫测试）评估神经康复情况。

结果：大蒜素处理降低了CCI小鼠中TNF-α、IL-1β、IL-6、ROS水平以及NLRP3和TLR4蛋白的表达，而IL-4和IL-10水平保持不变。此外，大蒜素还减少了CCI后的组织损伤和细胞死亡。转录组分析显示，线粒体自噬在大蒜素相关的分子通路中具有重要意义。流式细胞术和脂质组学分析表明，大蒜素促进了CL从IMM向OMM的转移。重要的是，大蒜素在CCI和Bv2细胞拉伸模型中均增加了PKC-δ的表达和PLS3的磷酸化，这与CL相关的线粒体自噬过程有关。这些结果表明，大蒜素通过减少与线粒体自噬相关的神经炎症，进一步在体外预防神经元损伤。选择性PKC-δ抑制剂Rottlerin显著降低了大蒜素减少神经炎症的能力，与运动功能和认知能力的恶化相关。因此，通过PKC-δ相关的线粒体自噬，大蒜素的给药也改善了CCI诱导的行为缺陷。

结论：本研究揭示了一种新机制，即大蒜素通过增强PKC-δ的表达和PLS3的磷酸化，促进CL向OMM的转移并激活线粒体自噬，从而减少TBI诱导的神经炎症。

（图文摘要）

【总结】

1. 动物模型构建与处理

（1）建立CCI小鼠TBI模型

（2）分组：对照组、TBI组、TBI+大蒜素组、TBI+大蒜素+PKC-δ抑制剂组

（3）检测指标：

炎症因子：TNF-α、IL-1β、IL-6（ELISA）

氧化应激：ROS水平（流式细胞术）

线粒体自噬标志物：LC3/COX IV共定位（免疫荧光）

行为学评估：转棒实验（运动功能）、Morris水迷宫（认知功能）

2. 细胞模型与机制验证

（1）Bv2小胶质细胞机械拉伸（模拟TBI）

（2）分组：对照组、拉伸组、拉伸+大蒜素组、拉伸+大蒜素+PKC-δ抑制剂组

（3）检测指标：

炎症通路：NLRP3、TLR4蛋白（Western blot）

线粒体自噬：CL脂质组学（IMM→OMM转移）、线粒体结构（透射电镜）

信号通路：PKC-δ表达、PLS3磷酸化（Western blot）

3. 功能验证与数据整合

（1）共培养系统：拉伸Bv2细胞与原代神经元共培养，检测神经元存活率（TUNEL染色）

（2）抑制剂阻断实验：Rottlerin抑制PKC-δ，验证其对炎症和自噬的调控作用

（3）组学分析：RNA测序（筛选PKC-δ/PLS3通路）、KEGG富集分析

4. 结论推导

大蒜素通过 PKC-δ↑ → PLS3磷酸化↑ → CL外翻至OMM → 线粒体自噬激活→ 抑制小胶质细胞炎症因子释放 → 改善神经元损伤及行为缺陷

【前言】

创伤性脑损伤（TBI）是全球死亡率和致残率的重要因素之一。TBI导致的神经功能缺陷是由原发性和继发性损伤机制共同作用的结果。手术可以修复创伤引起的初始脑组织损伤，这种损伤会导致结构破坏。随后的长期继发性损伤最终会导致神经元死亡。神经炎症被认为是这些事件中的关键病理过程。由病理状态的小胶质细胞引起的不受控制的神经炎症反应会导致神经功能障碍，并伴有身体、认知、情绪和行为症状。因此，进一步研究旨在抑制炎症效应并改善TBI后的预后是不可避免的。

大蒜素是一种源自大蒜的防御分子，具有多种生物学活性。大蒜素是一种硫代硫酸酯，属于反应性硫化物（RSS），它通过与谷胱甘肽和蛋白质中的巯基发生氧化还原反应发挥作用，这些反应被认为是其生物学活性的关键。大蒜素具有剂量依赖性的抗菌和抗真菌作用，能够成功抑制或破坏细胞，包括耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）等耐药菌株。氧化还原依赖机制是大蒜素作用的主要机制。在亚致死浓度下，大蒜素通过降低胆固醇和血压发挥心血管保护作用。研究表明，大蒜素可以通过PI3K/AKT通路减轻急性肺损伤。先前的研究表明，适当剂量的大蒜素可以保护神经元免受损伤，包括缺血性脑损伤和急性脊髓损伤。尽管已有研究记录了大蒜素在TBI相关神经损伤和炎症中的作用，但仍需要进行详细的体外研究，以阐明其潜在的抗炎和神经保护机制，特别是关于病理过程的调控。

线粒体自噬（mitophagy）是维持线粒体和细胞平衡的关键过程。激活线粒体自噬信号通路可有效减轻TBI患者的神经炎症。线粒体自噬过程的调控涉及越来越多的信号通路。心磷脂（cardiolipin, CL）通过转移到线粒体表面来触发线粒体自噬，其特异性识别依赖于自噬蛋白微管相关蛋白轻链3（LC3）。在大鼠的CCI诱导的线粒体自噬过程中，PLS3显著促进CL从线粒体膜间隙向线粒体外膜的转移。蛋白激酶C（protein kinase C, PKC）-δ可磷酸化PLS3的Thr 21位点，这可能影响其脂质转移活性。我们的研究表明，PKC-δ/PLS3/CL信号通路可能在介导大蒜素诱导的线粒体自噬和抑制TBI患者神经炎症中发挥独特作用。

本研究通过体外细胞拉伸模型和小鼠CCI模型证实，大蒜素通过增强线粒体自噬减轻TBI诱导的神经炎症。我们发现，大蒜素增加了线粒体自噬，并抑制了小胶质细胞诱导的神经炎症。此外，大蒜素诱导的线粒体自噬上调依赖于PKC-δ表达的增加，这促进了PLS3的磷酸化和CL向线粒体外膜的转移。迄今为止，尚未有研究报道大蒜素可调节与CL相关的线粒体自噬。因此，我们的研究扩展了对大蒜素调节神经炎症能力的理解，并系统地探索了大蒜素在CL相关线粒体自噬过程中的作用机制，揭示了其对TBI的治疗益处。

【结果】

1、在CCI损伤后观察到神经炎症反应

通过CCI损伤诱导小鼠的TBI（图1A）。收集损伤周围的组织并用于后续实验。为了评估CCI损伤后的神经炎症反应，我们检测了脑脊液中TNFα、IL-1β、IL-6、IL-4、IL-10和ROS的水平，以及损伤后不同时间点NLRP3和TLR4蛋白的表达。图1B展示了实验时间线。研究发现，在CCI后，脑脊液中TNFα、IL-1β、IL-6和ROS的水平显著增加，且在CCI后1天达到最高水平（图1C-F）。CCI后，IL-4和IL-10水平也有所增加，其中IL-4水平略有上升（图1G和H）。在CCI模型中观察到NLRP3和TLR4蛋白表达增加（图1I-K）。在CCI后1天达到峰值后，这些炎症因子的水平在CCI组中仍高于假手术组，尽管有轻微下降。基于这些结果，后续研究选择在CCI后1天进行，以最大化促炎和抗炎因子的相对水平。

2、大蒜素给药抑制TBI后的神经炎症反应

大蒜素的化学结构如图2A所示。大蒜素在CCI后以三种浓度（10 mg/kg、20 mg/kg和30 mg/kg）给药。研究发现，20 mg/kg的剂量是合适的，且该剂量的大蒜素能有效抑制神经炎症反应。当使用浓度为30 mg/kg时，抗炎效果更好。实验时间线如图2B所示。ELISA结果显示，大蒜素处理后脑脊液中TNFα、IL-1β、IL-6和ROS的水平降低（图1C-F）。然而，大蒜素给药对IL-4和IL-10水平的影响较小（图1G和H）。此外，大蒜素抑制了NLRP3和TLR4蛋白的表达（图1I-K）。TUNEL实验表明，20 mg/kg和30 mg/kg的大蒜素能减少神经元死亡（图1L和M）。H&E染色显示，随着大蒜素浓度的增加，组织损伤面积减小（图1N和O）。因此，大蒜素减轻了CCI诱导的神经炎症反应和神经元损伤。30 mg/kg的大蒜素组在减轻神经炎症方面与阳性对照药物依达拉奉的效果相当。然而，大蒜素的抗神经炎症作用的潜在机制仍需进一步研究。

3、大蒜素通过促进线粒体自噬减轻神经炎症

IL-1β、IL-6和TNFα主要由小胶质细胞产生和释放，而NLRP3和TLR4也主要在小胶质细胞上表达。TBI后小胶质细胞触发的神经炎症反应是导致主要神经功能障碍的重要继发性损伤。为了探索潜在机制，我们使用Bv2细胞进行体外拉伸实验，模拟TBI（图S1A）。测试了10 μM、20 μM和30 μM的大蒜素浓度，以确定Bv2细胞拉伸模型的合适浓度。拉伸诱导细胞活性增加，而30 μM的大蒜素能抑制这种增加（图S1B）。大蒜素给药抑制了炎症因子（图S1C-F），与TLR4和NLRP3表达的变化一致（图S1G）。30 μM的浓度能有效抑制炎症反应，因此被选为后续实验的浓度。

RNA测序分析（比较拉伸+大蒜素与拉伸组）表明，大蒜素与线粒体自噬过程密切相关（图S1H和I）。许多研究表明，线粒体自噬可以减轻过度的神经炎症，并延缓神经退行性疾病的进展。我们还报道了线粒体自噬通过清除受损线粒体，在大鼠CCI模型中发挥神经保护作用（Chao等，2019）。然而，大蒜素的抗神经炎症作用是否依赖于线粒体自噬尚未被研究。为此，我们设计了实验来检验这种潜在的依赖性，实验时间线如图3A所示。大蒜素处理增加了具有双层膜结构的线粒体数量（图3B）。

我们的研究结果表明，大蒜素抑制了细胞色素c从线粒体向细胞质的转移（图3C-D）。CCI损伤提高了LC3B II/I比值并降低了P62水平，表明自噬总体增强。CCI小鼠中线粒体蛋白标志物TOM40、COX IV和MnSOD水平降低，提示线粒体自噬在CCI损伤中的作用。大蒜素进一步降低了TOM40、COX IV和MnSOD的表达，但上调了总体自噬；然而，这种效应被线粒体自噬抑制剂Mdivi-1和自噬抑制剂3-MA逆转（图3E和图S2A-E）。大蒜素有效减轻了神经元损伤，表现为NeuN和MAP2水平增加。然而，Mdivi-1或3-MA的给药逆转了大蒜素的神经保护作用（图S3A、C和D）。当给予Mdivi-1或3-MA时，发现总体细胞死亡程度增加，尽管这种现象之前被大蒜素抑制（图S3B和E）。Mdivi-1和3-MA也阻碍了大蒜素对炎症的抑制作用（图3E-I和图S2F和G），并伴随着小胶质细胞数量的增加（图S4A和B）。此外，Mdivi-1和3-MA的作用没有明显差异。因此，线粒体自噬可能参与了大蒜素给药时对神经炎症的抑制。

4、大蒜素通过增加PLS3磷酸化促进Bv2细胞拉伸模型中的CL外化和线粒体自噬

进一步的GO分析中细胞组分术语突出了外线粒体膜（OMM）、OMM转位复合体和蛋白复合体的作用（图4A）。OMM作为启动线粒体自噬的特异性平台，心磷脂（CL）在膜上的外化是这一过程的信号。在此，我们通过Annexin V-FITC外化实验监测表面可及的CL，以研究大蒜素处理下的CL转位。结果显示，大蒜素给药后Annexin V-FITC的荧光强度显著增加，表明OMM上CL水平升高（图4B、C）。在经过拉伸和大蒜素处理的Bv2细胞中，观察到LC3与TOM40的共定位增强（图4D）。为了评估大蒜素在CL跨膜转运中的作用，我们分离了几乎纯净的线粒体内膜（IMM）和外膜（OMM）组分（图4E、F），用于脂质提取和LC-MS分析（图4G、H）。拉伸增加了CL向OMM的转运，而大蒜素进一步促进了这一过程，与之前的研究结果一致。

5、大蒜素（Allicin）通过PKC-δ依赖的方式在体外上调PLS3的磷酸化。

我们通过将原代神经元与Bv2细胞共培养来研究大蒜素对神经炎症损伤的抗炎作用（图5M）。在拉伸的Bv2细胞中使用大蒜素可以保护神经元免受神经炎症的侵害。在Bv2细胞中敲低PKC-δ会导致TUNEL阳性细胞数量增加（图5N、O）。通过免疫染色实验发现炎症因子在神经元中扩散，PKC-δ的抑制提高了IL-1β、IL-6和TNF-α水平，这与裂解的caspase 3的变化一致，即使在大蒜素存在的情况下也是如此（图S7A-F）。此外，我们还通过Western blot检测了神经元中裂解的caspase 3的表达，证实了免疫染色实验的结果（图S7G、J）。

6、大蒜素通过PKC-δ/PLS3/CL信号通路改善行为缺陷

随后，我们评估了大蒜素和PKC-δ对CCI诱导的神经炎症的体内效应。Rottlerin是一种选择性PKC-δ抑制剂，被用于抑制PKC-δ的活性（图6A），尤其是在小胶质细胞中（图S8A），并降低PLS3的磷酸化水平（图S8B）。实验的时间线如图6B所示。通过旋转杆和莫里斯水迷宫测试评估CCI损伤后的行为恢复。Rottlerin处理减少了LC3和COX IV的共定位（图S8C），同时增加了TOM40、COX IV、MnSOD、NLRP3和TLR4的水平。Rottlerin给药后，LC3B II/I比率也有所下降（图S8D和图9B-H）。大蒜素促进了CCI后损伤线粒体的吞噬，但这一过程被Rottlerin抵消（图S8E）。大蒜素降低了IL-1β、IL-6、TNF-α和ROS水平，但这些变化被Rottlerin阻断（图S8F-I）。此外，大蒜素通过H&E染色评估减少了损伤体积。然而，尽管存在大蒜素，Rottlerin给药导致损伤体积增加（图6C、D）。

在CCI损伤后两天，通过旋转杆测试评估运动功能。与接受CCI损伤的对照小鼠相比，接受大蒜素治疗的CCI小鼠的运动能力显著改善。CCI + 大蒜素 + Rottlerin组未表现出这种改善（图6E）。各组的最大耐受旋转速度相似，仅在假手术组和CCI组之间观察到显著差异（图6F）。在CCI损伤后14天，进行了莫里斯水迷宫测试。经过3天的训练，如我们之前的研究所述，不同小鼠组的潜伏期、距离和游泳速度保持一致，表明运动能力的变化没有影响隐藏平台训练（图S10A-C）。在隐藏平台训练第5天的小鼠轨迹分析（图6G）表明，接受CCI的小鼠找到平台的时间更长，覆盖的距离更多，而接受假手术的小鼠则不然。大蒜素改善了小鼠的表现，而接受Rottlerin注射的小鼠即使在大蒜素给药的情况下，学习平台位置的能力也显著下降（图6H、I）。在隐藏平台训练期间，所有测试组的小鼠游泳速度保持不变，无论接受何种处理（图6J）。

过去十年的研究强调了炎症在TBI后继发性损伤中的作用，其导致神经退行性和神经功能障碍。本研究聚焦于小胶质细胞——大脑中的巨噬细胞，其在组织损伤反应中发挥关键作用。小胶质细胞被激活后释放促炎细胞因子和神经毒性物质，导致神经元死亡或功能障碍。既往研究表明，大蒜素可以抑制小胶质细胞的激活，并减少IL-1β和TNF-α的分泌。然而，目前对于大蒜素在TBI诱导的神经炎症治疗中的作用仍缺乏新的重大进展。

本研究首次揭示线粒体自噬是大蒜素发挥抗炎效应的关键环节。尽管TBI后线粒体自噬被激活，但其对损伤进展的抑制作用较弱。增强线粒体自噬可能通过减少炎症介质的释放和减轻神经炎症来预防神经功能障碍。例如，激活线粒体自噬的药物如褪黑素可以通过抑制神经炎症改善TBI后的神经功能。

本研究进一步证实大蒜素诱导小胶质细胞的线粒体自噬，并通过检测PKC-δ、PLS3的磷酸化以及CL相关的线粒体自噬，揭示了大蒜素的作用机制。大蒜素显著上调PKC-δ的表达，并激活PLS3的磷酸化，促进CL从线粒体内膜（IMM）向OMM的转运。CL在OMM上的暴露是诱导线粒体自噬的关键信号，并有助于减轻神经炎症反应。此外，共培养系统的实验结果进一步支持了这些发现。研究表明，大蒜素在细胞拉伸和小鼠TBI模型中均增强了线粒体自噬，强调了PKC-δ/PLS3/CL信号通路在减轻神经炎症和促进神经功能恢复中的作用。

与其他神经保护药物相比，大蒜素具有独特的优势。首先，大蒜作为烹饪草药已被使用数千年，且口服后能快速且几乎完全吸收，这使得本研究更接近临床实践。其次，大蒜素具有较长的生物半衰期，表明其活性稳定。其活性代谢物的峰值浓度在摄入后4小时达到，并可持续检测到30小时。此外，既往研究未发现大蒜素在神经细胞和动物模型中存在毒性，使其成为TBI药物研究的有前景的候选药物。

PKC-δ主要由小胶质细胞释放，在调节神经炎症中发挥重要作用。PKC-δ的敲低通过下调NF-κB减轻帕金森病中的小胶质细胞促炎反应。本研究发现，大蒜素显著增强了小胶质细胞中PKC-δ的表达，表明其可能是大蒜素调节线粒体自噬和减轻TBI后神经炎症的潜在靶点。

此外，本研究还测量了IL-4和IL-10水平——TBI的抗炎生物标志物。大蒜素处理后，脑脊液中IL-4和IL-10水平未显著变化。类似地，在疟疾小鼠模型中，大蒜素未改变IL-4水平，且由于对Treg功能影响较小，IL-10水平也未显著变化。此外，研究还表明，很少有药物能够显著改变IL-10水平。

局限性：首先，未检测大蒜素对PINK1/Parkin、AMPK/ULK1和BNIP3/BNIP3L等线粒体自噬相关通路的影响。其次，将促炎M1型小胶质细胞转变为抗炎M2型小胶质细胞是减轻神经炎症和促进神经康复的有效方法，但本研究未评估大蒜素对小胶质细胞极化（M1或M2）的影响。尽管如此，本研究仍聚焦于大蒜素诱导的CL依赖性线粒体自噬。

综上所述，本研究揭示大蒜素通过激活PKC-δ/PLS3/CL通路，促进CL在OMM上的暴露，触发线粒体自噬，进而减轻TBI诱导的神经炎症。

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