复旦大学罗小金团队揭示MAPK级联信号激酶通过影响BR信号传导调控水稻株型和产量的新机制

近日，复旦大学罗小金研究员团队在Plant Biotechnology Journal杂志在线发表了题为OsMAPKKK5 Affects Brassinosteroid Signal Transduction via Phosphorylating OsBSK1-1 and Regulates Rice Plant Architecture and Yield的研究论文，揭示了MAPK级联信号激酶OsMAPKKK5通过磷酸化水稻油菜素甾醇（brassinosteroids，BRs）信号细胞膜受体OsBSK1-1，抑制BR信号传导，从而调控水稻株型和产量的分子遗传机制。

水稻是全球超过一半人口的主食，随着人口的增长和农业用地的减少，提高水稻产量成为当务之急。水稻产量受株型、穗型和粒型等多性状综合影响，这些性状由复杂的调控网络控制。然而，这些农艺及产量性状往往是此消彼长的，寻找协同调控各个性状、提升最终产量的核心基因至关重要。另外，为了进一步提高产量，需要解析影响主要产量相关成分的复杂遗传网络，突破产量性状之间的耦合瓶颈，实现协同改良。

BR是一种甾醇植物激素，可调节植物在不同阶段的生长和发育。与水稻BR合成和信号转导相关的突变体常常表现为植株生长受阻、发育不良、产量下降。丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信号级联近些年来也被发现参与调控水稻产量，但BR信号和MAPK信号之间如何串扰，及其共同调控水稻株型和产量网络仍待深入解析。复旦大学罗小金团队挖掘出一个调控水稻株型和产量的关键基因OsMAPKKK5。通过功能解析发现，OsMAPKKK5编码一个MAPK级联信号激酶，与OsBSK1-1互作并使其磷酸化。进一步研究阐明，这种磷酸化会使二者的互作更紧密，使OsBSK1-1无法充分发挥作为BR受体行使传递BR信号的功能。全文主要研究结果如下：

1. OsMAPKKK5负调控水稻株型和产量

研究团队利用CRISPR/Cas9技术敲除了水稻品种Bing1B中的OsMAPKKK5基因，发现与野生型相比，敲除株系的水稻株高、分蘖数、单株产量和籽粒大小均显著增加。而OsMAPKKK5过表达水稻株系的表型相反，这表明OsMAPKKK5在水稻株型和籽粒发育中起到了负调控作用。

2. OsMAPKKK5与OsBSK1-1互作，且OsBSK1-1正调控水稻株型和产量

通过体内、体外的蛋白免疫实验，研究团队证实了OsMAPKKK5与OsBSK1-1之间直接相互作用。通过对CRISPR/Cas9和基因过表达水稻遗传株系的表型考察发现，敲除OsBSK1-1后，水稻株高降低，分蘖减少，单株产量下降，粒长和粒宽下降。OsBSK1-1过表达株系则明显株高增加，分蘖更多，单株产量更高，粒长、粒宽都显著增加。因此，OsBSK1-1是水稻株高和籽粒发育的正调节因子。

3. OsMAPKKK5和OsBSK1-1在BR信号通路中作为一对拮抗调节因子发挥作用

由于OsBSK1-1是拟南芥BR信号激酶（BR signal kinase 1，BSK1）在水稻中的同源蛋白，OsMAPKKK5又与其互作，研究团队利用体外BR激素施加探究了这2个基因能否参与水稻BR信号响应。结果表明，OsMAPKKK5敲除系和OsBSK1-1过表达系对BR更敏感；相反，OsMAPKKK5过表达系和OsBSK1-1系敲除系的BR敏感性显着降低。这说明OsMAPKKK5和OsBSK1-1拮抗调节水稻中的BR信号传导。

4. OsMAPKKK5磷酸化OsBSK1-1并增强它们之间的相互作用

OsMAPKKK5的激酶结构域是二者互作的关键结构域，这暗示着OsMAPKKK5可能对OsBSK1-1进行磷酸化。通过质谱分析，研究团队找到了OsMAPKKK5磷酸化OsBSK1-1的具体氨基酸位点（S57和T65），并利用点突变解析了这两个位点的具体作用。当S57和T65突变为丙氨酸（A）之后，二者之间的互作减弱，这意味着OsMAPKKK5对OsBSK1-1的磷酸化增强了二者之间的相互作用。

那么这种磷酸化会不会影响OsBSK1-1与其他BR信号通路关键蛋白的互作关系？研究团队聚焦到OsBRI1（水稻BR信号起始受体）─OsBSK1-1─OsPPKL1（水稻BR信号中间激酶）这条信号转导的关键通路。利用分裂荧光素酶酶活恢复和荧光能力共振转移技术，发现OsMAPKKK5对OsBSK1-1的磷酸化会削弱OsBSK1-1与OsBRI1和OsPPKL1之间的相互作用。也就是说，OsMAPKKK5通过磷酸化OsBSK1-1，削弱了OsBRI1─OsBSK1-1─OsPPKL1传递BR信号的强度。

5. OsMAPKKK5与OsBSK1-1调控的基因表达谱类似，并通过抑制BR信号的传递效率间接阻碍OsBZR1进入细胞核发挥转录功能

研究团队对过表达OsMAPKKK5和敲除OsBSK1-1株系的分蘖期叶片进行RNA-seq分析，发现与野生型相比，两个遗传株系的差异基因中有831个是重叠的，且这些基因的调控方向是一致的，这表明OsMAPKKK5和OsBSK1-1可能参与相似的通路。

在OsMAPKKK5过表达株系与野生型植株的差异基因中，研究团队发现了大量OsBZR1（水稻BR信号终端转录因子）调控转录的基因，有趣的是，OsBZR1本身的表达量并没有显著变化。OsBZR1作为水稻BR信号转导的终端效应转录因子，其在没有BR信号刺激时会保持磷酸化状态，滞留于细胞质中；受到BR信号的刺激下才可以被去磷酸化，然后进入细胞核发挥转录功能。前文证明了OsMAPKKK5可以阻碍BR信号，那么这种阻碍作用可能最终影响了OsBZR1的入核效率，从而使OsMAPKKK5起到负调控水稻BR信号的功能。通过亚细胞定位、蛋白免疫实验，研究团队证明即使外源施加高浓度的BR，当OsMAPKKK5过表达时，OsBZR1蛋白仍保留在细胞质中。这些结果支持前面的假设，即OsMAPKKK5可以通过干扰BR信号通路来调节OsBZR1的亚细胞定位，进而影响了其作为转录因子调控下游基因的功能。

综上所述，OsMAPKKK5作为重要的MAPKKK家族激酶，对水稻产量性状的调控表现出一因多效性，影响株高、分蘖数、籽粒大小等性状。OsMAPKKK5通过磷酸化OsBSK1-1抑制其作为BR受体传递BR信号的能力，使BR下游重要调控因子OsBZR1无法进入细胞核，负调控其下游基因表达来抑制BR信号转导，进而影响产量性状。在水稻驯化和改良过程中，OsMAPKKK5存在明显的籼梗分化，在栽培稻中并没有受到强烈选择，因此，使用CRISPR/Cas9系统敲除OsMAPKKK5、或通过杂交用功能缺陷的OsMAPKKK5等位基因替换强功能的OsMAPKKK5等位基因，有望进一步改良水稻的株型和产量。本研究阐述了水稻产量性状调控的网络机制，为水稻高产育种提供了理论依据和基因资源。

OsMAPKKK5和OsBSK1-1调控水稻株高和产量性状的分子机制

复旦大学生命科学学院博士生严佩雯和青年副研究员王莹为本文共同第一作者，罗小金研究员为通讯作者。上海市农科院曹黎明研究员团队、已毕业硕士生朱瑜、博士生马福盈等也参与了该项工作。本研究得到了上海市教委科研创新计划重大项目、上海市东方英才（乡村振兴）拔尖人才项目和国家自然科学基金资助。

https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/pbi.70008