Circulation丨周斌/何奔/王利新建立谱系示踪新技术揭示平滑肌细胞起源异质性与主动脉相关疾病的作用

主动脉是人体最大的动脉，负责将富含氧气的血液从心脏输送到全身各个器官。然而，主动脉并非坚不可摧。在某些情况下，主动脉的结构完整性会因血管重塑而受损，导致主动脉瘤的形成。主动脉相关疾病在全球发病率较高，对公众健康构成了严重威胁。目前全球约有1.13亿年龄≥40岁的外周动脉和主动脉疾病 （PAAD） 患者，患病率约为1.5%，且随着年龄的增加而升高。在≥70岁的人群中，患病率高达15%-20%，而在≥80岁的人群中，患病率更是攀升至20%-30%。在我国，主动脉疾病的发病趋势同样不容忽视。近年来，随着我国生活水平的提高和人口老龄化趋势的加剧，以及高血压患者检出率和有效控制率不高，主动脉疾病的发病趋势日益恶化。主动脉瘤作为一种常见的主动脉扩张性疾病，我国约有40万患者，然而按现有病人量和每年得到治疗的病例来看，只有不足1‰的患者得到治疗。主动脉相关疾病的危害极大。如主动脉瘤在破裂前往往无明显症状，一旦破裂，高速、高压的动脉血会立即喷射入腹腔或胸腔，导致患者在短短几分钟内失血数千毫升，随即出现休克，大出血而死亡。因此，深入了解主动脉瘤的发病机制，特别是主动脉的区域异质性，对于改善风险分层、预后预测和手术决策具有重要意义【1】。

主动脉从心脏的左心室发出，向上延伸形成升主动脉，然后向左后方弯曲形成主动脉弓，最后向下延伸为降主动脉，穿过膈肌进入腹腔。升主动脉和主动脉弓位于胸腔内，称为胸主动脉；而降主动脉穿过膈肌后进入腹腔，称为腹主动脉。主动脉的这种解剖学特点决定了其在不同区域的生理功能和病理变化存在差异。主动脉的区域异质性不仅体现在解剖学上，还体现在其生理功能上。胸主动脉和腹主动脉在血流动力学、血管壁结构和功能方面存在显著差异【2】。胸主动脉主要承受来自心脏的高压血流，其血管壁较厚，弹性较好，能够承受较大的压力变化。相比之下，腹主动脉的血管壁相对较薄，弹性较差，更容易受到血流剪切力的影响。此外，胸主动脉和腹主动脉在血管平滑肌细胞的表型和功能上也存在差异，这可能与主动脉瘤的形成有关。主动脉的区域异质性在病理学上也表现为不同的易感性。胸主动脉和腹主动脉在动脉粥样硬化、血管重塑和动脉瘤形成方面存在显著差异。研究表明，腹主动脉更容易受到动脉粥样硬化的影响，而胸主动脉则更容易发生夹层和破裂。这种差异可能与主动脉不同区域的血管壁结构、细胞组成和分子机制有关。例如，胸主动脉和腹主动脉在蛋白酶表达、细胞信号通路激活以及炎症反应方面存在差异，这些差异可能导致主动脉瘤在不同区域的形成和发展。

近日，中国科学院分子细胞科学卓越创新中心周斌课题组、上海交通大学医学院附属胸科医院何奔教授团队与复旦大学医学院附属中山医院王利新教授团队合作在Circulation上发表了文章Exploring Origin-dependent Susceptibility of Smooth Muscle Cells to Aortic Diseases via Intersectional Genetics。该研究利用Cre-loxP和Dre-rox的双同源重组酶，开发了系统性的交叉遗传示踪新技术，成功实现了对主动脉不同发育起源平滑肌细胞（SMCs）的精准谱系示踪和遗传靶向。该研究工作不仅为探索来源依赖性或位置特异性主动脉血管相关疾病提供了新的技术，同时能够全面分析不同发育起源的SMC细胞亚群对病理的影响，为将来针对性的研究和治疗干预铺平道路，为理解主动脉疾病的发病机制和开发针对性治疗方法提供了新的平台。

平滑肌细胞 （SMCs） 是主动脉的主要细胞成分，它们不仅参与血管的收缩和舒张，还在维持血管结构的完整性方面发挥着重要作用。近年来，许多细胞谱系追踪研究表明，不同血管或同一血管的不同段落由来自不同祖细胞的SMC群体组成，每种群体都有其独特的谱系和发育历史【3】。例如，主动脉的升段和降段的SMCs可能来自不同的祖细胞。这种异质性在血管系统中表现为一种镶嵌模式，即在同一个动脉树中存在不同的SMC亚型。这些不同起源的SMCs之间往往有明显的边界，几乎没有混合。在胚胎发育过程中，SMCs的形成涉及多个祖细胞群体。这些祖细胞群体在不同的发育阶段和不同的解剖位置对SMCs的形成做出贡献。例如，第二心场 （SHF） 的细胞主要对对升主动脉的外侧SMC细胞层有重要贡献，而心脏神经嵴 （CNC） 起源的细胞则对升主动脉内侧和主动脉弓的SMC层有贡献【4】。此外，体节来源细胞及间皮发育起源的细胞也分别对降主动脉和内脏中血管的SMCs有贡献等。血管平滑肌细胞的异质性在血管疾病的发生和发展中具有重要意义。

不同祖细胞群体形成的SMCs具有不同的谱系特异性。这些SMCs在细胞形态、功能和对刺激的反应上表现出明显的差异。这种谱系特异性可能与祖细胞在胚胎发育过程中的基因表达模式和信号通路激活有关【5】。不同起源的SMCs在血管重塑、动脉粥样硬化和动脉瘤形成等病理过程中表现出不同的易感性。例如，腹主动脉瘤 （AAA） 主要涉及来自体节的SMCs，而胸主动脉瘤 （TAA） 则更多地涉及来自SHF和CNC的SMCs。

为了探究主动脉的谱系异质性，研究人员首先选定了几个细胞谱系特定表达的基因作为启动子构建了一系列Dre的工具小鼠来标记主动脉不同发育起源的祖细胞群，以此来实现对不同发育起源所有细胞的遗传示踪。该研究工作分别利用了Isl1启动子构建了Isl1-Dre的工具小鼠用于标记第二心场 （SHF） 起源的所有细胞、利用Wnt1启动子构建了Wnt1-Dre的工具小鼠用于标记心脏神经嵴 （CNC） 起源的所有细胞、利用Meox1启动子构建了Meox1-DreER的工具小鼠用于标记体节中胚层 （Som） 起源的所有细胞以及利用Upk3b启动子构建了Upk3b-Dre的工具小鼠用于标记间皮 （Mes） 起源的所有细胞。

要想实现对不同发育起源平滑肌细胞更特异性的遗传靶向示踪，就需要结合双同源重组的交叉遗传学示踪技术。同时研究人员也构建了Myh11-RSR-CreER与Myh11-CrexER的工具小鼠，这两个工具小鼠可以结合以上四个靶向不同发育起源的Dre工具小鼠，将CreER或Cre的表达限定在Dre启动子基因与Myh11基因同时表达的细胞中，从而实现了对不同发育起源平滑肌细胞的特异性示踪。在该研究工作中，每一个特异性的遗传示踪靶向新技术都分别进行了验证。起源于第二心场、定位于升主动脉的SMCs通过Isl1-Dre;Myh11-RSR-CreER;R26-tdT或Isl1-Dre;Myh11-CrexER;R26-tdT的三基因型小鼠实现了特异性的靶向示踪，该工具而不会对第二心场起源的非平滑肌细胞或其他空间位置上的平滑肌细胞进行非特异性的靶向示踪，研究人员将该工具命名为SHF-SMC-CreER/Cre。定位于主动脉弓处的心脏神经嵴起源的平滑肌细胞可以通过Wnt1-Dre;Myh11-RSR-CreER;R26-tdT或Wnt1-Dre;Myh11-CrexER;R26-tdT的三基因型小鼠实现特异性的靶向示踪，研究人员将该工具命名为CNC-SMC-CreER/Cre。起源于体节的降主动脉上的平滑肌细胞则可以通Meox1-DreER;Myh11-RSR-CreER;R26-tdT或Meox1-DreER;Myh11-CrexER;R26-tdT的三基因型小鼠实现特异性的靶向示踪，研究人员将该工具命名为Som-SMC-CreER/Cre。对于发育起源来自间皮、定位于内脏器官上的平滑肌细胞则可以通过Upk3b-Dre;Myh11-RSR-CreER;R26-tdT或Upk3b-Dre;Myh11-CrexER;R26-tdT的三基因型小鼠实现特异性的靶向示踪，研究人员将该工具命名为Mes-SMC-CreER/Cre。通过以上四个遗传示踪工具的构建，研究人员成功实现了对四个不同发育起源的平滑肌细胞亚群的特异性靶向示踪。

TGF-β信号通路在心血管发育和疾病中发挥着至关重要的作用【6】。TGF-β家族成员广泛参与细胞增殖、分化、凋亡以及细胞外基质 （ECM） 重塑等过程。在心血管系统中，TGF-β信号通路通过调节SMAD蛋白来实现其生物学功能。SMAD蛋白作为下游效应分子，能够将TGF-β信号传递至细胞核，调控目标基因的表达。然而，TGF-β信号通路在主动脉瘤相关疾病中的作用仍存在争议。一方面，TGF-β信号通路的异常激活被认为与主动脉瘤的发病机制密切相关。例如，TGF-β信号通路的过度激活可能导致血管平滑肌细胞 （SMCs） 的表型转变和功能障碍，进而促进主动脉瘤的发生和发展。另一方面，TGF-β信号通路也可能具有保护作用。一些研究表明，TGF-β信号通路的适度激活可以维持血管稳态，防止主动脉瘤的形成。前人的研究表明，主动脉瘤的发病机制在主动脉的不同段落中也表现出显著差异，TGF-β信号通路在不同主动脉段的保护机制也有所不同，主动脉瘤的发病机制在胸主动脉和腹主动脉之间也存在差异，表明不同主动脉段对疾病的易感性也是存在差异的。

为了探究TGF-β信号通路在不同发育起源SMCs相关主动脉疾病中的作用，研究人员分别用SHF-SMC-CreER工具在第二心场起源的SMCs中敲除Tgfbr2基因，发现与对照组小鼠相比，在angiotensin II的作用下实验组小鼠升主动脉壁的稳态被破坏，动脉瘤的形成加快。使用用CNC-SMC-Cre的遗传靶向工具特异性的在心脏神经嵴起源的SMCs中敲除Smad4基因后，发现几乎所有的实验组小鼠中都观察到主动脉瘤的表型。同时，主动脉瘤特异性地发生在心脏神经嵴起源的主动脉弓处而不在主动脉的其他位置，这也证实了研究人员所开发的特异性遗传示踪靶向工具的准确性，强调了该工具在研究不同发育起源主动脉疾病相关的潜在靶基因方面的实用性。

接下来，研究人员又通过单细胞测序技术对Smad4-CNC-SMCKO小鼠和Smad4-CNC-SMCCtrl对照组小鼠的主动脉弓和降主动脉分别进行了无偏差的转录组分析。发现Smad4-CNC-SMCKO组小鼠的主动脉弓 （AA） 组与其他三个对照组之间存在明显的细胞群体差异。在Smad4-CNC-SMCKO的AA实验组中观察到一群独特的调节型SMCs群，其特征是典型SMCs标记物的表达降低，同时出现了未成熟标记物的表达增加。表明Smad4基因敲除后，SMCs的基因表达发生了显著改变，导致其表型从典型的SMCs向调节型细胞发生转变，这种转变可能与主动脉弓的病理变化密切相关。

不同发育起源SMCs对动脉瘤疾病生成的影响是一个复杂而重要的研究领域。我们的研究工作利用Cre-loxP和Dre-rox双同源重组酶，开发系统性的双重组酶介导的交叉遗传示踪新技术，成功实现了对主动脉不同发育起源平滑肌细胞 （SMCs） 的精准靶向示踪。为动脉瘤的干预和治疗提供了新的思路和方法。未来，随着研究的不断深入和医疗技术的不断进步，相信我们将能够更深入地理解平滑肌细胞在动脉瘤生成中的作用，并开发出更加有效的治疗手段。

图注：利用双同源重组酶介导的交叉遗传谱系示踪新技术实现对不同发育起源SMCs的特异性靶向，探究了TGF-β信号通路在不同发育起源SMCs与相关主动脉疾病中的作用。

上海交通大学医学院附属胸科医院博士后韩溪檬，助理研究员李逸和复旦大学医学院附属中山医院博士研究生王恩慈为该论文的共同第一作者。中国科学院分子细胞科学卓越创新中心周斌研究员、上海交通大学医学院附属胸科医院何奔教授与复旦大学医学院附属中山医院王利新教授为该论文的共同通讯作者。该工作得到了胸科医院沈玲红主任、中科院药物所李燕研究员、国家蛋白质科学中心杨晓研究员、阿斯利康公司Qing-Dong Wang博士、江南大学马鑫教授、上海动物中心沈如凌博士、香港中文大学吕爱兰教授的大力指导和帮助。

文章链接：

https://www.ahajournals.org/doi/10.1161/CIRCULATIONAHA.124.070782

制版人：十一

参考文献

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2. Sawada, H., Katsumata, Y., Higashi, H., Zhang, C., Li, Y., Morgan, S., Lee, L.H., Singh, S.A., Chen, J.Z., Franklin, M.K., et al. (2022). Second Heart Field-Derived Cells Contribute to Angiotensin II-Mediated Ascending Aortopathies.Circulation145, 987-1001. 10.1161/CIRCULATIONAHA.121.058173.

3. Majesky, M.W. (2007). Developmental basis of vascular smooth muscle diversity.Arterioscler Thromb Vasc Biol27, 1248-1258. 10.1161/ATVBAHA.107.141069.

4. Sawada, H., Rateri, D.L., Moorleghen, J.J., Majesky, M.W., and Daugherty, A. (2017). Smooth Muscle Cells Derived From Second Heart Field and Cardiac Neural Crest Reside in Spatially Distinct Domains in the Media of the Ascending Aorta-Brief Report.Arterioscler Thromb Vasc Biol37, 1722-1726. 10.1161/ATVBAHA.117.309599.

5. Cheung, C., Bernardo, A.S., Trotter, M.W., Pedersen, R.A., and Sinha, S. (2012). Generation of human vascular smooth muscle subtypes provides insight into embryological origin-dependent disease susceptibility.Nat Biotechnol30, 165-173. 10.1038/nbt.2107.

6. Gillis, E., Van Laer, L., and Loeys, B.L. (2013). Genetics of thoracic aortic aneurysm: at the crossroad of transforming growth factor-beta signaling and vascular smooth muscle cell contractility.Circ Res113, 327 -340. 10.1161/CIRCRESAHA.113.300675.

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