江南大学改造酿酒酵母，实现甘草素高效合成

甘草素是一种重要的黄酮类化合物，传统上从甘草植物中提取。然而，植物提取法存在生态和效率问题，限制了其大规模应用。尽管已有研究尝试在微生物中重建甘草素的合成途径，但产量仍然较低，处于概念验证阶段。

近日，江南大学周景文团队在 Journal of Agricultural and Food Chemistry 发表题为“Engineering Saccharomyces cerevisiae for Efficient Liquiritigenin Production”的文章，通过改造酿酒酵母半乳糖诱导系统、开发双重 NADPH 供应系统等多种优化策略，成功将酿酒酵母改造为甘草素的“生产工厂”。该工程菌株在 5 L 发酵罐中甘草素产量可高达 867.67 mg/L，为黄酮类及其他天然产物合成提供了新思路。

改造酿酒酵母并令其高效生产甘草素存在一系列难题。一方面，引入异源的甘草素合成途径，会增加酵母细胞的代谢负担，导致生长缓慢，甘草素产量并不高；此外，合成甘草素所需的关键物质如 NADPH 供应不足等，也限制了甘草素的产量。因此，为了解决这些难题，研究人员采用了多种创新代谢工程策略。

半乳糖诱导系统的改造。在微生物发酵过程中，细胞生长和产物合成通常会相互竞争有限的资源，如碳源、能量和辅酶，从而降低目标产物的合成效率。因此，研究人员利用酿酒酵母的代谢特性，特别是其“双相生长转换”（diauxic shift）现象，重新设计了酵母的代谢调控网络。

双相生长转换是指微生物在含有两种底物的批量培养中，表现出的一种代谢现象。具体来说，微生物通常不会同时代谢两种可用的糖，而是按顺序消耗它们，从而导致两个独立的生长阶段。

研究中使用了两个具有不同表达特征的双相生长启动子 P_HXT1 和 P_HXT7，分别用于调控半乳糖诱导系统的抑制子 GAL80 和激活子 GAL4。这种设计随着葡萄糖水平的降低逐步增强异源途径基因的表达，同时保持了抑制-去抑制的动态平衡。

细胞在生长阶段（葡萄糖充足）抑制合成途径，而在生产阶段（葡萄糖耗尽）激活合成途径，实现了在葡萄糖存在时，酵母优先利用葡萄糖进行生长，而在葡萄糖耗尽后，酵母代谢模式发生切换，进入生产阶段。通过这种方式，细胞可以在生长阶段快速积累生物量，而在生产阶段则专注于合成甘草素，从而显著提高生产效率。

优化 NADPH 供应。在甘草素的合成过程中，NADPH 作为一种重要的辅酶，可以直接影响到合成关键酶（如查尔酮还原酶 CHR）的活性，因此它的供应至关重要。为了提高甘草素的合成效率，研究人员设计了一个双通道 NADPH 供应系统，这一系统通过两条独立的途径来增强 NADPH 的再生能力。

首先，研究人员关注的是直接 NADPH 再生途径，即通过优化磷酸戊糖途径（PP 途径）来增加 NADPH 的供应。PP 途径是细胞内 NADPH 的主要来源之一，通过葡萄糖的代谢直接产生 NADPH。然而，单纯依赖 PP 途径可能会破坏酵母原有的代谢平衡，导致中间代谢物的积累，进而影响细胞的整体代谢效率。

因此，研究人员进一步探索了第二条途径，即基于磷酸化的 NADPH 再生。

实验结果表明，双通道 NADPH 供应系统的构建显著提高了甘草素的合成效率，将甘草素与柚皮素（甘草素合成前体）的比例从 1.1 提高到 1.76。

代谢途径的简化与优化。为了进一步优化甘草素的合成途径，研究人员提出了利用内源代谢产物来指导异源天然产物合成的概念。他们分析了酵母的代谢网络，发现芳香酯类化合物（如苯乙酸酯）与黄酮类化合物的合成途径具有相似性。黄酮类化合物的合成中，香豆酸和乙酰辅酶 A 是关键前体物质。

研究人员发现，优化芳香酯类化合物的合成，能够间接增加这两种前体物质的供应。具体而言，研究人员通过对与芳香酯合成相关的酶（像 ATF1、EAT1 和 DGA1）进行调整，使更多原本流向其他代谢途径的物质，被引导到黄酮类化合物的合成路径上，提高了香豆酸和乙酰辅酶 A 的供应效率。

最终，通过多种策略进行优化后，在 5 L 发酵罐中，经过优化的酵母菌株能够生产出 867.67 mg/L 的甘草素。该研究展示了通过代谢工程和发酵优化相结合的策略，能够显著提高黄酮类化合物的微生物合成效率，为相关天然产物的工业化生产提供了新的思路。

1. https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acs.jafc.4c10455

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