Cell| 尼帕病毒聚合酶复合物的结构和功能的分析

尼帕病毒（Nipah Virus）是具有包膜的负义单链RNA病毒，属于副黏病毒科（Paramyxoviridea），与埃博拉病毒是近亲，其天然宿主是果蝠。1998年，尼帕病毒在马来西亚首次爆发，感染了数百个人和动物，造成了大量的经济损失。之后，尼帕病毒也在其他国家，例如菲律宾、印度和孟加拉，有过爆发。时至今日，印度和孟加拉依旧每年有尼帕病毒爆发的报道。尼帕病毒感染会使人患致死性脑炎，其致死率在40%～75%之间。然而，目前尚没有可以用来预防或治疗尼帕病毒感染的有效药物或抗体。除了致死性脑炎，尼帕病毒感染者也可能是无症状的，这大大提高了尼帕病毒大范围爆发的可能性，并可能威胁全球人类的安全健康。最近的研究已经揭示了尼帕病毒的RNA聚合酶结构，详见），然而具体的催化机制细节以及抗药性还没有得到阐明。

近日，哈佛医学院Jonathan Abraham团队与波士顿大学医学院Rachel Fearns团队（共同一作为胡思德、Heesu Kim、杨盼）合作在Cell上发表了文章Structural and functional analysis of the Nipah virus polymerase complex(尼帕病毒聚合酶复合物的结构和功能的分析)。该研究分析了尼帕病毒聚合酶复合物（包括一个L蛋白和四个P蛋白）的结构，并利用生化实验寻找并验证了几个影响尼帕病毒聚合酶复合物活性的位点。最后，利用分子动态对接（Molecular dynamics docking），他们解释了一个药物对多种副黏病毒的L蛋白有效但是对尼帕病毒的L蛋白无效的原因，使之有望成为药物设计的起点。

研究团队首先利用冷冻电镜技术，解析了尼帕病毒聚合酶复合物NiV L-P的高分辨率的结构。在对该复合物结构进行分析的时候，他们发现了几个特殊的位点。第一个是一段特殊的L蛋白的序列，该序列的结构在尼帕病毒的L蛋白上（氨基酸603～709）没有被观测到。然而通过氨基酸序列比对，他们发现相比于其他的L蛋白，NiV L的这段序列明显较长，例如，尼帕病毒的L蛋白比埃博拉病毒的L蛋白在这一段多100多个氨基酸。由于L蛋白有一个保守的右手“大拇指-手指-手掌”（Thumb-fingers-palm）结构，而这一段序列在尼帕病毒的L蛋白中位于手掌区域，这部分序列被称为“手掌插入”（palm insert）。

第二个是其中一个P蛋白单体（P4）的序列，被成为多肽延伸（peptide extension）。这个部分与另外一个结合在L蛋白RdRp结构域的P蛋白到XD分别位于RdRp结构域的两侧。有意思的是，这个多肽延伸在其他的副黏蛋白结构上没有被观测到，然而，在肺病毒科（Pneumoviridae）上可以看到其P蛋白的一部分在这个位点走势高度一致。值得一提的是，P蛋白在不同科甚至不同属里面都不是保守的，其序列乃至长度差别都非常大。所以这个结果表明，P4的多肽延伸可能是一个高度保守的特点。

为了研究这些特点还有一些其他的保守的解雇特点，比如锌指结构域（zinc finger motif）和HR结构域等对L-P蛋白复合物活性的影响，该团队利用微基因组实验（minigenome assay）对这些突变体进行了验证。微基因组实验包括两个系统，一个是多循环系统，另一个是一步复制系统。在多循环系统中，细胞可以表达T7 RNA聚合酶，在将基因组、L、P和N的基因转化到细胞之后，T7 RNA聚合酶可以启动L、P和N蛋白的表达，并将基因组复制以产生反义基因组。然后在L-P蛋白复合物的作用下，反义基因组可以转录产生mRNA或者复制产生基因组。在一步复制系统中，由于5‘短有一个突变，在这个系统中，可以利用基因组产生反义基因组和mRNA，而反义基因组不能在L-P蛋白复合物的作用下生成基因组。然后，通过RNA印记对基因组、反义基因组和mRNA进行探测，可以判断这些突变影响的是基因组复制还是mRNA转录。

试验结果表明，HR结构域、palm insert和锌指结构域都会让L-P复合物失去RNA合成的能力，P4 多肽延伸则会导致其活性下降为野生型的30%左右。这些结果表明，这些位点都会影响L-P复合物的活性。

有意思的是，由于其他的L蛋白的palm insert很短，如埃博拉病毒，该团队一开始猜测palm insert不会影响其活性。然而，出乎意料的是，生化实验表明palm insert删除会导致L蛋白失去合成RNA的能力。这表明palm insert参与RNA合成的过程在单链负义RNA病毒目（Mononegavirales）的不同病毒中是不同的。换言之，虽然单链负义RNA病毒的聚合酶复合物大体结构类似，表明它们合成RNA的过程也大体相同，但是它们在细节上可能有较大的差别。

最后，该团队利用分子动态对接，将GHP-88309对接到聚合酶复合物中。GHP-88309是一个广谱到抗副黏病毒的药物，可以抑制多种副黏病毒L蛋白的活性，然而，这个药物对尼帕病毒无效。之前的结果表明，将NiV L蛋白的H1165突变成Y，可以让GHP-88309的抑制效果提高60多倍。对接结果表明，GHP-88309的环氮距离H1165的咪唑基太远（6.1 Å），不能形成氢键，而Y1165则将它缩短为3 Å，这使GHP-88309可以有效地与L蛋白结合。而通过AlphaFold3，该团队预测了L-RNA的复合物的结构，这个结构则表明GHP-88309的结合位点恰好位于模版RNA出L蛋白的位置，使RNA延伸不能得以继续下去，抑制了RNA的合成。

本研究为L-P聚合酶复合物在RNA合成中的作用提供了新见解，并且找到几个可以影响其活性的位点，增加抗尼帕病毒的药物设计的可能性。而分子动态对接和结构预测的结果，则合理地解释了GHP-88309对尼帕病毒L蛋白无效的原因，接下来的研究可以利用这一结果，以GHP-88309为起点进行改造，从而实现对尼帕病毒L蛋白的有效抑制。

https://www.cell.com/cell/fulltext/S0092-8674(24)01434-X

文章转载自BioArt