上海
点评 | 朱欢/周斌（中国科学院分子细胞科学卓越创新中心）
在生物学研究中，细胞谱系示踪是一项至关重要的技术，它能够追踪目标细胞在发育、分化及疾病发生过程中的变化。然而，传统的谱系示踪方法往往面临分辨率低、信息记录不完整等挑战。基于CRISPR/Cas9条形码的谱系示踪技术显著提高了谱系分辨率的精度，但其仍存在一些局限性。其中一个重要问题是临近靶点间大片段缺失从而造成信息记录失真。因此，开发一种更为准确的谱系示踪技术显得尤为重要。
2025年1月28日，中国科学院广州生物医药与健康研究院彭广敦研究组在Cell Reports杂志上在线发表了文章Dual-nuclease single-cell lineage tracing by Cas9 and Cas12a。该研究成功地将CRISPR-Cas9和Cas12a两种基因编辑工具结合应用于单细胞谱系示踪，为深入理解细胞命运决定过程中的转录调控机制提供了有力工具。
在此项研究中，科研人员提出了将Cas9与Cas12a两种核酸酶结合使用的策略，即DuTracer单细胞谱系示踪技术。该技术通过分离这两种基因编辑核酸酶的表达时间，大大降低了由于多靶点同时编辑造成跨靶点删除的几率。研究团队首先在HEK293T细胞中验证了DuTracer技术的谱系重建能力，发现其能够记录较深的细胞分裂层级。随后，在两个小鼠胚胎干细胞三维分化模型中，DuTracer技术同样展现出了出色的性能，不仅规避了位点间大片段缺失的发生，同时还有效地记录了不同细胞间的谱系关系。结合单细胞转录组数据和示踪数据，研究团队揭示了不同细胞类型之间的克隆耦合关系，挖掘并验证了决定神经中胚层发育命运偏好性的驱动因子。该研究的成功不仅为单细胞谱系示踪技术领域提供了新的思路和方法，也为深入理解细胞命运决定过程中的转录调控机制提供了有力支持。未来，随着技术的不断发展和完善，DuTracer技术有望在再生医学、癌症发生等领域发挥重要作用。
论文通讯作者是中国科学院广州生物医药与健康研究院彭广敦研究员。中国科学院广州生物医药与健康研究院助理研究员陈城、博士后廖远鑫和博士生朱淼为该文的共同第一作者。
https://www.cell.com/cell-reports/fulltext/S2211-1247(24)01456-6
专家点评
朱欢博士/周斌研究员（中国科学院分子细胞科学卓越创新中心）
谱系追踪是理解生物体发育、疾病发生和组织稳态等复杂生物过程的关键技术。该技术通过标记细胞的遗传信息，追踪细胞的起源、分化和迁移，从而揭示细胞间的谱系关系和细胞命运演化规律。早期研究主要依赖于病毒标记，染料标记，以及基于同源重组酶的遗传标记系统。这些方法在早期为我们提供了宝贵的细胞谱系信息。然而，这些方法往往存在标记效率不高、非特异性标记、分辨率有限等问题。近年来，CRISPR-Cas9 基因编辑技术的发展为谱系追踪带来了革命性的突破。基于 CRISPR 的谱系追踪系统，如GESTALT，homing CRISPR，CARLIN/DARLIN和 CREST等系统，利用 Cas9 酶在基因组特定位点引入插入或缺失 (indel) 突变，这些突变作为遗传标记，可以被细胞继承并用于谱系重建。尽管基于 CRISPR 的方法取得了很大进展，但仍然存在一些挑战。例如，传统的 CRISPR-Cas9 谱系追踪方法容易产生靶位点间的较大缺失，导致信息丢失，条形码多样性不足，限制了复杂谱系的追踪能力，以及编辑效率和覆盖率有待提高。这些问题阻碍了我们更深入地理解复杂的细胞谱系动态变化。
近期，中国科学院广州生物医药与健康研究院彭广敦研究员团队提出了 DuTracer 技术，其核心创新在于采用了双核酸酶系统。DuTracer 同时利用 Cas9 和 Cas12a 这两种正交的 CRISPR 核酸酶，它们分别编辑不同的靶点，并通过不同的诱导系统进行时序控制。这种设计显著降低了位点间缺失的风险，因为同时切割多个靶点的可能性大大降低，从而保留了更多的谱系信息。为了增加条形码的多样性，DuTracer 在每个细胞中插入多个靶点阵列的副本，并且在每个靶点前加入了独特的 14 个碱基对的整合条形码（intBC）。这些 intBC 可以区分不同拷贝的靶点，并帮助揭示细胞的克隆关系。DuTracer 利用 Tet-On 和 4-OHT-ERT 诱导系统来分别控制 Cas9 和 Cas12a 的表达。这种设计使得研究人员能够精确地控制编辑事件的时序，从而在研究复杂的细胞谱系动态变化时，例如在细胞分化过程中，可以有效地分离不同阶段的编辑事件。DuTracer 结合信息论分析方法，量化了条形码过程和细胞分化之间的耦合关系。通过这种分析，研究人员可以更深入地理解细胞命运决定的分子驱动因素，例如文中发现的转录因子 Foxb1 在神经中胚层祖细胞 (NMP) 命运选择中的作用。DuTracer 已经在多种细胞模型中得到了验证，包括 HEK293T 细胞系，小鼠胚胎干细胞 (mESC)，小鼠胚状体 (EB)，和神经中胚层类器官 (NMO)，这表明该技术具有广泛的应用潜力。
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