天津大学元英进等代谢工程改造酿酒酵母实现香兰素高效合成

香兰素（香草醛，vanillin）是目前全球使用最广泛的调味剂之一，也是全球产量最大的合成香料品种之一，素有“食品香料之王”之称。这种调味剂具有香荚兰豆香气以及浓郁的奶香，能够起到增香和定香作用，已经广泛应用于食品、饮料、化妆品、日用化学品及医药等行业。

天然香兰素可以从香草提取物中纯化。但由于香草豆荚产量有限，提取工序繁琐，产量较低，导致天然香兰素价格昂贵，且供应不足；鉴于化学合成香兰素在各种应用中的局限性，微生物转化已成为生产天然香兰素的关键可持续方法。

香兰素的生物合成已在多种微生物中实现，包括大肠杆菌、酿酒酵母、恶臭假单胞菌、枯草芽孢杆菌等，但由于香兰素对微生物细胞有毒性作用，通过长时间发酵很难获得高滴度。

近日，天津大学的李炳志、元英进、刘志华等人在 Journal of the American Chemical Society 杂志上发表了一篇题为“Redesigned Pathway for De Novo Synthesis of Vanillin and Coconversion of Multiple Renewable Substrates in Saccharomyces cerevisiae”的研究成果。

本研究构建了多种可再生底物共同转化的酿酒酵母香兰素从头合成工艺。以葡萄糖为底物，重新设计构建了香兰素的合成途径，通过缩短合成途径、优化整合位点，实现了香兰素的高效从头合成。在此基础上，研究人员又引入木糖异构化途径，成功实现了木质纤维素衍生的多种组分的共同转化。

为了实现以葡萄糖为原料异源合成香兰素的短而高效的途径，设计对羟基苯甲酸作为重要中间体，并从莽草酸途径生成。构建对羟基苯甲酸在酿酒酵母中的合成途径：删除具有芳香醛积累能力的底盘分支酸变位酶 Aro7，以阻断预苯酸通量，激活莽草酸途径；删除磷酸甘油酸变位酶 PGM1，以阻止6-磷酸葡萄糖转化为 1-磷酸葡萄糖。引入来自大肠杆菌的分支酸丙酮酸裂解酶 UbiC，其可以将分支酸转化为对羟基苯甲酸，并引入来自大肠杆菌的莽草酸激酶 EcoAroL，提高对羟基苯甲酸产量。

为了初步测试工程化的酿酒酵母底盘合成香兰素的潜力，通过每 24 小时提供约 10 g/L 葡萄糖进行补料发酵，发酵 120 小时后，产生了 1059.5 mg/L 对羟基苯甲酸。与对香豆酸相比，对羟基苯甲酸可以直接还原为对羟基苯甲醛，从而绕过咖啡酸中间体的形成，避免了咖啡酸的甲基化步骤，后者通常是限制整个途径效率的瓶颈。

以对羟基苯甲酸作为重要的中间体，下游途径从对羟基苯甲酸到对羟基苯甲醛、原儿茶醛、香兰素。

对羟基苯甲酸易被还原为对羟基苯甲醛，研究人员引入羟基化反应将对羟基苯甲醛转化为原儿茶醛。并发现来自谷氨酸棒状杆菌的 Pcg-1 与羧酸还原酶 (CAR) 的共同作用下，得到的原儿茶醛滴度最高。

原儿茶醛合成香兰素由来自烟草的 O-甲基转移酶 NtCOMT 完成，此外，通过提高甲基供体的供应量，为香兰素的高效合成提供了保障。

为了获得能够稳定遗传的菌株，研究人员将羟化酶、O-甲基转移酶和羧酸还原酶都整合到菌株基因组中。再将 NtCOMT 整合到常用位点 PDC5 后，获得的菌株在 96 h 摇瓶发酵中产香兰素 363.0 mg/L，发酵培养基中仅积累了少量的中间体和副产物，包括 54.3 mg/L 对羟基苯甲酸、24.5 mg/L 原儿茶醛、18.8 mg/L 对羟基苯甲醛和 66.5 mg/L 香草醇。每 24 小时添加约 10 g/L 葡萄糖，发酵 144 小时后可获得 533.0 mg/L 香兰素。

这项研究也探究该合成途径对于木质素衍生单体转化的效率。木质素衍生单体包括对香豆酸、阿魏酸、香兰酸、木糖等。如在木质纤维素衍生的单糖中，木糖是仅次于葡萄糖的第二丰富的可发酵糖。本研究选择木糖异构酶途径从木糖合成香兰素，并以木糖作为后续碳源供体。将 RsXI （来自白蚁的木糖异构酶基因）和 XKS1（木酮糖激酶基因）分别引入菌株后，可转化木糖生产 94.5 mg/L 对羟基苯甲酸或 16 mg/L 香兰素。为了防止干扰葡萄糖转化途径，团队巧妙的设计了引入上述反应的启动时间。葡萄糖和木糖的存在促进了香兰素的合成，浓度达到 423.7 mg/L。

通过设计关键酶的表达模式，成功实现了葡萄糖、木糖、香草酸、对香豆酸和阿魏酸共转化生成香兰素，有效拓展了酵母细胞工厂的底物范围，为木质纤维素生物质的高值化利用提供了新的策略，对推进香兰素的工业化生产、优化木质纤维素生物质的高效利用具有重要意义。

香兰素对工程菌株的毒性作用可能是限制香兰素产量进一步提高的主要原因。UDP-糖基转移酶可以催化香草醛转化为葡糖香草醛，而葡糖香草醛对酵母细胞而言是一种无毒化合物。

根据其催化活性、底物特异性和对香草醛的亲和力，引入来自拟南芥的糖基转移酶 UGT72B1 替换葡聚糖酶基因 EXG1，得到的菌株在摇瓶发酵过程中每 24 h 加入 10 g/L 葡萄糖，经过 120 h 发酵产葡萄糖香兰素 1294.0 mg/L，相当于 626.4 mg/L 香兰素。

最终，通过一系列的基因工程和代谢工程改造，研究人员成功地构建了一种高效的酵母工厂，能够从葡萄糖、木糖和多种生物质衍生的单体底物中生产香兰素。在摇瓶发酵中，香兰素的产量高达 533.0 mg/L，结合原位产物去除策略和发酵过程强化，在多底物共转化中实现了 1745.5 mg/L 葡糖香兰素（相当于 845.1 mg/L 香兰素），并在 5 L 生物反应器中从葡萄糖合成了 7476.5 mg/L 葡糖香兰素（相当于 3619.4 mg/L 香兰素）。这项研究有望促进香兰素的工业化生产和木质纤维素生物质资源的高效利用，从而为可持续的生物质经济做出贡献。

参考文献：

1.https://pubs.acs.org/doi/10.1021/jacsau.4c00918?articleRef=test

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