Cell Stem Cell | 杜鹏课题组利用全能性干细胞实现小鼠早期胚胎发育过程精准重建

来源：北大生科

早期胚胎发育是生命科学领域的核心研究方向之一。胚胎从受精卵开始发育，经过基因组激活（zygotic genome activation, ZGA）、快速细胞分裂和谱系分化，最终形成囊胚，为胚胎着床及后续发育奠定基础。在这一过程中，囊胚内三谱系的形成 —— 内细胞团（inner cell mass, ICM）、原始内胚层（primitive endoderm, PrE）和滋养外胚层（trophectoderm, TE）—— 标志着胚胎命运决定的关键转折点。然而，受限于胚胎样本的稀缺性和实验条件的限制，如何构建精准模拟早期胚胎发育的体外系统，仍是该领域亟待解决的科学难题。

2021 年，北京大学杜鹏教授课题组通过抑制剪接体，首次捕获并稳定培养了小鼠全能性干细胞（mouse totipotent blastomere-like cells, mTBLCs）(Shen et al., 2021)。与经典的多能性干细胞不同，mTBLCs 能够重现全能性卵裂球的特征，为构建从单细胞开始的分化和囊胚形成模型提供了理想的 「 种子细胞 」。随后，在 2024 年，研究团队利用相同的策略成功获得了人的全能性干细胞 (Li et al., 2024)，为进一步探索全能性及其在胚胎发育研究中的应用提供了重要工具。

基于 mTBLCs 的这一特性，2025 年 1 月 17 日，杜鹏课题组在 Cell Stem Cell 杂志在线发表了题为 「Mouse totipotent blastomere-like cells model embryogenesis from zygotic genome activation to post implantation」 的研究论文。在这项研究中，作者进一步优化了 mTBLCs 培养条件，并开发了 mTBLCs 自发分化和单细胞起始的类囊胚形成系统，mTBLCs-类囊胚具有 EPI、PrE 和 TE 谱系，并能进一步形成着床后阶段的卵圆柱胚样结构，重现了从 ZGA 至囊胚形成的完整发育过程。这一突破为研究全能性、细胞命运决定以及早期胚胎形态发生提供了新的技术平台，也为早期发育的基础与转化研究开辟了新的可能性。

图 1. 通过 mTBLCs 模拟小鼠早期胚胎发育的关键事件的模式图

在本研究工作中，作者主要有以下发现：

1. 该研究通过优化培养基（2MYCP），显著提高了 mTBLCs 的增殖速度和长期自我更新能力，主要通过加入 2-DG、Minocycline、Y-27632、CHIR-99021 和 PlaB 等因子。在此过程中，PlaB 发挥了关键作用，通过抑制剪接驱动了从多能性向全能性的转变，而 Oct4 基因的去除并未影响 mTBLCs 在 2MYCP 培养基中的自我更新能力，表明 Oct4 不是维持细胞全能性的必要条件。2MYCP 培养基中，Wnt 信号通路在 mTBLCs 中被激活，且 Wnt 信号通路与细胞周期、增殖通路的激活与 mTBLCs 的快速自我更新能力密切相关。进一步的实验结果表明，抑制 Wnt 信号通路可显著抑制 mTBLCs 的增殖，证明 Wnt 信号对于 2MYCP 培养基中 mTBLCs 的快速扩增至关重要，但它并不参与维持 mTBLCs 的全能性。

图 2. Wnt 信号的激活促进了 mTBLCs 的快速扩增

2. mTBLCs 具有独特的表观基因组特征，这些特征有助于其全能性维持和快速自我更新。通过 ATAC-seq 和 CUT&Tag 分析，发现 mTBLCs 的启动子区域（TSS）H3K27me3 和 H3K9me3 整体水平下降，而 H3K4me3、H3K27ac 和 RNA Pol II 标记整体水平未发生显著变化，其表观特征与早期胚胎的初期胚胎细胞（如 2 细胞阶段）相似。此外，mTBLCs 具有比 PSCs 更多的宽的 H3K4me3 域（broad domain），以及更少的二价修饰基因（bivalent gene），且 MERVL 转座子在 mTBLCs 中具有显著的 H3K4me3 标记。Wnt 信号通路的激活进一步增强了与细胞周期和增殖相关基因的 H3K4me3 富集，从而促进了 mTBLCs 的快速增殖。

图 3. mTBLCs 具有类似早期卵裂球的特定表观特征

3. 本研究进一步评估了 mTBLCs 在体内外的分化潜力。在嵌合体实验中，通过单细胞数据，捕获到了 EGFP 标记的 mTBLCs 生成的 13 种细胞，其中包括 7 个胚外谱系和 6 个胚内谱系，证明了其在嵌合小鼠中的双向发育潜能。此外，mTBLCs 通过类胚体（EBs）和畸胎瘤实验也都展示出了胚内外双向分化潜能，产生了包括神经、心脏和肾脏等三胚层来源的细胞，也激活了包括经典滋养层标志基因，展示其能够生成胚外滋养层样谱系。总体而言，mTBLCs 具有强大的双向发育潜力，能够分化为各种胚内外谱系，成为评估全能干细胞发育潜力的重要工具。

图 4. mTBLCs 具有强大的胚内外双向分化潜能

4. 本研究利用 mTBLCs 建立了一个模拟胚胎着床前发育的体外分化模型，以克服现有体外分化系统的挑战。在基础分化培养基中培养 mTBLCs 约 3-4 天后，细胞形态发生显著变化，形成了胚胎干细胞（ESC）、胚外内胚层干细胞（XEN）和滋养层干细胞（TSC）样的克隆。RNA-seq 分析显示，mTBLCs 在分化过程中激活了不同发育阶段的基因，经历了从早期初级基因组激活（minor ZGA）到主要基因激活（major ZGA）的转变。免疫组化验证了 mTBLCs 能够分化为上胚层（EPI）、胚外滋养层（TE）和原始内胚层（PrE）等谱系。单细胞 RNA 测序揭示，mTBLCs 在分化过程中产生了涵盖 2 细胞、4 细胞、8 细胞及囊胚阶段的多种细胞类型，拟时间分析显示 mTBLCs 经历了两次命运决定，首次产生 TE 样细胞和 ICM/EPI 样细胞，随后 ICM/EPI 样细胞分化产生了 PrE 样细胞。

研究进一步发现，在自发分化过程中，mTBLCs 还产生了 Zscan4+ 和 Zscan4- 两类基因组激活样细胞（ZLCs）。拟时间分析表明，只有 Zscan4- ZLCs 能够成功分化为 EPI、PrE 和 TE 三大谱系。因此，本研究提出，主要的 ZGA 调控网络可能至少可以分为由 Zscan4 表达标记的两个独立部分。同时，Zscan4 的表达可能并不是进一步干细胞命运决定所必需的。这一观察结果也与人类 TBLC 的自发分化过程一致，在这一过程中，经典的 ZGA 标志基因（如 ZSCAN4/5A、DUXA/B 和 TPRX1 等）完全没有被诱导表达 (Li et al., 2024)。这些发现不仅进一步证实了 mTBLCs 的内在全能性，也为探索哺乳动物胚胎发育过程中的共性机制提供了新视角。

图 5. mTBLCs 自由分化体系模拟着床前胚胎发育

5. 此外，本研究发现，在没有任何外源性信号干预的情况下，单个 mTBLC 能够经历扩增、极化和压实过程，最终高效率的形成结构完整的类囊胚（blastoid）。这一类囊胚结构不仅包含内细胞团、原始内胚层和滋养外胚层等胚胎样细胞，且未见异常中间状态的细胞，mTBLC 来源的囊胚在转录组上与体内囊胚更为接近，三个谱系的特定标志物富集。并且类囊胚可以在体外继续培养，发育成类似卵圆柱的后植入阶段结构。也可以将类囊胚移植到假孕小鼠中，其成功植入并形成卵圆柱样着床后胚胎结构。

图 6. mTBLCs 生成类囊胚并进一步发育成着床后卵圆柱样胚胎

综上，本研究首次建立了基于 mTBLC 的自发分化和胚胎样结构形成系统，成功模拟了胚胎早期发育的多个关键环节。尤其是在细胞命运决定和全能性研究领域，这一系统为理解早期胚胎发育中的细胞命运转变提供了新的视角。此外，该研究还为胚胎发育模型的应用开辟了新的可能性，未来基于这一系统，科学家们有望深入研究胚胎发育异常的分子机制，探索病理过程，甚至为解决不孕不育等生育医学问题提供全新解决方案。

杜鹏为该论文的通讯作者。北京大学生命科学学院博士后彭冰、北京大学前沿交叉学科研究院博士研究生王清仪、生命科学学院博士研究生张飞翔为本文的并列第一作者。北京大学生命科学学院博士后申辉参与了部分工作。该项工作得到了北京高等学校卓越青年科学家计划、北京市自然科学基金、国家自然科学基金、国家重点研发计划基金的支持。

参考文献：

[1] Li, S., Yang, M., Shen, H., Ding, L., Lyu, X., Lin, K., Ong, J., and Du, P. (2024). Capturing totipotency in human cells through spliceosomal repression. Cell 187, 3284-3302.e23. https://doi.org/10.1016/j.cell.2024.05.010.

[2] Shen, H., Yang, M., Li, S., Zhang, J., Peng, B., Wang, C., Chang, Z., Ong, J., and Du, P. (2021). Mouse totipotent stem cells captured and maintained through spliceosomal repression. Cell https://doi.org/10.1016/j.cell.2021.04.020.

研究组介绍

杜鹏：

杜鹏，北京大学博雅特聘教授，北京大学生命科学学院、北大-清华生命联合中心，研究员、博士生导师。

实验室研究领域：

本课题组的研究集中在 RNA 生物学与干细胞生物学。我们综合运用传统的生物化学，分子生物学，结合高通量测序，基因组学，生物信息学等手段来分析和鉴定未知的 RNA 调控通路，研究相关 RNA 调控通路在胚胎干细胞的分化命运决定和早期胚胎发育中的功能。同时，我们致力于在动物细胞中重组植物或微生物中特异的 RNA 调控通路，并分析其潜在的对于基础科学研究和转化医学研究中的价值。

主要研究课题：
1. 鉴定未知的 RNA 调控元件及分析其对应的调控机制。
2. 研究 RNA 调控如何决定胚胎干细胞全能性及多能性状态的转化及分化命运。
3. 哺乳动物细胞中植物或微生物 RNA 调控通路的重建及其潜在应用。

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