APSB-IF14+: 南开大学揭示人参皂苷CK通过靶向PHD2改变胶原蛋白与血小板粘附从而抑制血栓

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导读

血小板在生理止血和病理血栓形成中不可或缺，其中血小板与内皮胶原的粘附是血栓形成的关键初始步骤，在当前的抗血小板治疗中经常被忽视。本研究旨在阐明人参皂苷CK如何增强血流动力学循环，缓解血瘀，并揭示治疗机制。根据急性软组织损伤模型下CK改善微循环障碍，CK被确定为脯氨酸羟化酶2（PHD2）抑制剂，有效抑制血小板与胶原蛋白的粘附。靶向PHD2调节胶原羟基化修饰，从而影响其三维结构的形成，降低血管性血友病因子（VWF）与胶原之间的结合亲和力，最终抑制血栓形成。小鼠DIC模型证实了这一机制的有效性，证明了CK缓解循环系统疾病的可行性。当Phd2在小鼠肺部被敲除时，肺栓塞显著减少。此外，批准用于其他疾病的PHD2抑制剂也表现出类似的抗血栓形成作用。当PHD2抑制剂与阿司匹林联合使用时更有效地抑制了大鼠的动脉血栓形成。这些发现为开发抗血小板药物或扩大现有PHD2抑制剂在治疗血栓性疾病中的治疗应用提供了重要见解。

人参皂苷CK靶向PHD2，通过调节胶原蛋白的三维结构来减少血小板粘附并增强血液循环，为针对血栓性疾病的治疗提供了见解。

论文ID

原名：Ginsenoside CK targets PHD2 to prevent platelet adhesion and enhance blood circulation by modifying the three-dimensional arrangement of collagen

译名：人参皂苷CK通过改变胶原蛋白的三维排列，靶向PHD2，防止血小板粘附，促进血液循环

期刊：Acta Pharmaceutica Sinica B

IF：14.7

发表时间：2024.12

通讯作者：白钢，侯媛媛

通讯作者单位：南开大学

实验设计

实验结果

1. CK改善大鼠急性软组织损伤

急性软组织损伤的特征是局部微循环障碍，导致血流受损和血液粘度增加。为了探索CK的潜在机制，我们采用了一种大鼠急性软组织损伤模型。在以局部缺氧为特征的急性软组织损伤大鼠模型中，选择多功能抗氧化剂乙酰半胱氨酸（NAC）作为阳性对照。我们根据图1A中概述的实验程序进行药物给药和治疗。结果显示，与对照组相比，mod组的肿胀明显增加，而CK（12.5和25mg/kg）治疗减少组织水肿（图1B）。此外，受伤部位的综合评分也表明，CK显著改善了组织损伤（图1C）。随后使用H&E和Masson染色观察受伤的软组织切片（图1D和E）。与mod组相比，CK和NAC组胶原纤维增殖、肌纤维排列不规则或坏死以及出血和严重血瘀症状减轻。

图1 CK改善大鼠急性软组织损伤。（A）大鼠软组织损伤模型构建过程的示意图。（B）测量受伤部位的肿胀程度。（C）软组织损伤评分统计及软组织H&E（D）和Masson（E）染色分析。（F-I）在低（1和3秒）、中（30秒）和高（200秒）剪切条件下测定全血粘度。软组织损伤大鼠的红细胞（J）、白细胞（K）、淋巴细胞（L）和中性粒细胞（M）计数。与对照组相比，###P<0.001；与mod组相比，**P<0.01，***P<0.001（n=6）。

软组织损伤导致血管活性物质、前列腺素和其他炎症介质在损伤部位积聚，导致微循环障碍级联。实验结果（图1F-I）表明，在成型后的不同剪切条件下，全血粘度显著增加。然而，NAC和CK处理显示出不同程度的改善。正如预期的那样，mod组的血浆红细胞（RBC）计数、白细胞（WBC）计数，淋巴细胞（LYMPH）和中性粒细胞（NEUT）显著升高（图1J-M），表明存在炎症和组织损伤。这些计数在干预后显示出不同程度的减少。总之，上述分析表明，CK显著改善了大鼠的血液循环障碍，减轻了软组织损伤引起的炎症损伤。

2. CK影响HIF-1信号通路

非靶向血浆代谢组学用于分析CK在体内影响的代谢产物和相关途径。过滤后，我们发现存在22种显著差异代谢物，并用热图进行了聚类分析（图2A）；根据KEGG代谢途径分析了不同代谢物的功能和富集水平。结果表明，CK主要作用于HIF-1信号通路、胆碱代谢、牛磺酸和次牛磺酸代谢（图2B）。在缺氧环境中，CK干预后，图2C显示了两种显著的差异代谢物，即α-酮戊二酸（2-OG）和维生素C（Vc）。这些代谢物在调节HIF-1α的羟基化修饰中与PHD2错综复杂地联系在一起。缺氧使HIF-1α逃避泛素化和降解，从而激活其进入细胞核并启动包括VEGF在内的基因转录表达。靶向抑制PHD2可促进HIF-1α活化并增加VEGF表达（图2D）。随后，我们评估了受损软组织中HIF-1信号通路中关键蛋白的表达。如图2E所示，PHD2蛋白的表达不受CK的影响；然而，CK处理组HIF-1α及其下游蛋白标志物VEGF的表达增加。上述数据表明，在软组织损伤的背景下，CK和HIF-1信号通路在抑制PHD2功能方面存在潜在的相关性。

图2 大鼠软组织损伤的非靶向血浆代谢组学分析与评价。（A）受CK影响的显著差异代谢物的聚类分析。（B）基于显著差异代谢物对代谢途径的富集分析。（C）CK对HIF-1信号通路中关键代谢产物2-OG和Vc的影响。（D）PHD2及其相关代谢产物在HIF-1α信号通路中的作用示意图。（E）免疫印迹检测CK对PHD2、HIF-1α和VEGF表达的影响。与mod组相比，*P<0.05，**P<0.01（n=6）。

3. CK靶向PHD2蛋白

为了探索CK的潜在靶点，我们按照之前报道的方法进行了DARTS测定，使用SDS-PAGE对链霉蛋白酶消化蛋白带的分析显示，CK组和模型组在软组织损伤大鼠中存在明显差异（图3A）。此外，如果蛋白质的CK/mod比值低于0.75（蓝点）或高于1.25（红点），则根据HPLC-MS/MS分析，这些蛋白质被认为是差异的。我们共鉴定出15种差异表达的蛋白质（图3B）。然后，我们对HIF-1信号通路相关蛋白进行了联合分析，其中PHD2（比率为1.59）和转铁蛋白（比率为0.56）是CK靶蛋白的最可能候选者。鉴于转铁蛋白主要参与血浆中铁离子的转运，我们的重点转向研究PHD2和CK之间的相互作用，并通过蛋白质印迹分析进行了验证（图3C）。分子对接分析表明，CK能够同时占据PHD2蛋白的催化口袋和底物结合口袋，显示出-6.9千卡/摩尔的结合能（图3D）。

图3 PHD2蛋白被鉴定为CK的靶标。（a）SDS-PAGE上CK对受损软组织蛋白影响的DARTS分析。（B）通过HPLC-MS/MS分析鉴定CK的潜在靶蛋白。（C）DARTS样品上PHD2靶蛋白的蛋白质印迹。与mod组（n=3）相比，*P<0.05。（D）CK分子与PHD2蛋白的分子对接。（E）用或不用50μmol/L CK处理的PHD2蛋白的FTSA分析。（F）CK和PHD2（KD=18.0μmol/L）的SPR分析。（G）CK和PHD2的MST分析（KD=17.6μmol/L）。

然后我们表达并纯化了PHD2蛋白（支持信息图S2），以评估PHD2和CK之间的结合亲和力。FTSA分析表明，50μmol/L CK使PHD2的熔解温度提高了4.2°C（ΔTm）（图3E）。SPR实验表明，CK与固定的PHD2蛋白结合，解离常数（KD）为18.0μmol/L（图3F）。此外，图3G显示，通过MST分析，CK和PHD2的结合亲和力约为17.6μmol/L。这些发现明确地证实了CK特异性靶向PHD2，导致其结构稳定性的构象变化。

4. CK通过抑制脯氨酸羟化酶影响胶原结构

胶原蛋白分子由三条多肽链组成，它们具有Gly-X-Y氨基酸的重复序列。这些链交织在一起，在脯氨酸羟化酶（包括PHD2）的催化下形成稳定的三螺旋结构。胶原纤维的组装过程如图4A所示。为了评估CK对胶原蛋白结构的影响，最初通过MST在约KD=670 nmol/L下测量胶原蛋白与PHD2之间的结合亲和力。CK给药可以破坏这种相互作用（图4B）。图4C显示了胶原蛋白中羟脯氨酸（HYP）含量的定量。在PHD2存在下，HYP含量增加，而5μmol/L CK预处理抑制了HYP的形成。

图4 CK通过抑制脯氨酰羟化酶影响胶原蛋白结构。（A）PHD2羟基化修饰胶原蛋白结构的示意图。（B）CK对PHD2-胶原相互作用的MST分析。（C）CK对胶原蛋白中HYP含量的影响。与胶原蛋白组相比，#P<0.05。与PHD2组（n=5）相比，***P<0.001。（D）胶原蛋白α1链蛋白质图谱鉴定流程图。CK对代表性胶原α1肽羟基化率（E）或羟基化数（F）的影响。（G）施用或不施用PHD2或CK的胶原蛋白结构的SEM成像分析。

此外，我们对胶原蛋白中的代表性α1链进行了蛋白质分析，通过SDS-PAGE分离（图4D）。在凝胶内酶水解后，我们检测到羟基化修饰和代表性肽的信息。结果表明，PHD2可以催化羟基化率（图4E）或羟基化次数（图4F）的增加，而CK处理可以减弱胶原蛋白中羟基化修饰的形成。

为了可视化胶原蛋白结构的变化，我们对胶原蛋白进行了SEM分析。图4G中的证据表明，天然胶原蛋白具有柔软的多层海绵状结构，其特征是松散、纤维状和多孔的微观结构。在被PHD2修饰后，由于纤维直径减小和网络互连性增强，胶原蛋白结构变得更加致密。此外，CK处理有效地改变了胶原蛋白的稳定结构。

5. CK通过破坏VWF和胶原蛋白之间的结合来减少血小板粘附

血管表面暴露的胶原蛋白显著增强血小板粘附，并在血流条件下促进血栓形成。我们在研究了CK通过PHD2介导的脯氨酸羟基化对胶原蛋白结构的影响后，我们开始评估其对血小板与胶原蛋白粘附的影响。如图5A所示，我们的发现表明，在PHD2和胶原蛋白相互作用后，大量血小板粘附在基质上，并在微孔板上形成聚集体。然而，用CK或PHD2抑制剂IOX2处理明显损害了血小板在胶原蛋白上的扩散和血小板间相互作用。

图5 CK降低血小板粘附，破坏VWF和胶原蛋白之间的结合。（A）CK对微孔板上涂覆胶原蛋白的血小板粘附荧光成像的影响。与对照组相比，###P<0.001。与mod组（n=3）相比，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。（B）VWF胶原相互作用图。CK影响PHD2介导的（C）胶原-血小板粘附、（D）胶原-VWF结合和（E）胶原-VVF血小板的粘附。与对照组相比，###P<0.001；与mod组（n=6）相比，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。（F）VWF和胶原蛋白的MST分析。（G）PHD2对VWF胶原相互作用的影响。（H）CK对VWF与胶原相互作用的影响。

血小板上的GPIb-IX-V复合物在VWF因子的存在下粘附在胶原纤维上，构成了血小板粘附在胶原表面的主要机制。这一过程与PHD2介导的胶原蛋白羟基化有着错综复杂的联系（图5B）。为了阐明CK在血小板与胶原蛋白粘附中的关键作用，我们进行了VWF与涂有微孔板的胶原蛋白之间的相互作用试验。CK对血小板粘附的抑制作用通过荧光指示抗体检测胶原结合的血小板（图5C）和胶原结合的VWF（图5D）得到证实。研究表明，PHD2介导的胶原羟基化增强了结合亲和力，而CK处理破坏了VWF和胶原之间的相互作用，从而减弱了血小板对胶原的粘附（图5E）。

此外，我们进一步采用MST技术来评估VWF和胶原蛋白之间的粘附强度。如图5F所示，很明显，VWF与胶原蛋白的直接结合最小。然而，当用PHD2修饰时，脯氨酸羟基化胶原蛋白对VWF具有很强的亲和力，KD=94.1 nmol/L（图5G）。相反，CK将这些实体之间的粘附力显著降低了近十倍，KD=865.6 nmol/L（图5H）。这些发现证实了CK有效地阻碍了VWF和胶原蛋白之间的相互作用，最终阻碍了血小板粘附。

6. CK抑制胶原蛋白脯氨酸羟基化改善大鼠血液循环

随后，我们通过在软组织损伤大鼠模型中靶向PHD2阐明了血液循环调节的机制。为了确认是否存在受损的软组织，我们在图6A中采用Van Gieson染色显示严重出血，血细胞聚集，胶原纤维大量积聚（红色），肌纤维束紊乱（黄色）。相反，我们在NAC或CK处理组中观察到显著改善。之后，我们使用荧光显微镜捕捉组织中暴露胶原蛋白的3D结构。如图6B所示，与对照组相比，mod组显示出更明显的胶原蛋白暴露，在破裂的血管周围形成了复杂的网络结构。NAC或CK的给药有效地减弱了这种影响。

图6 CK通过改变软组织损伤大鼠的胶原结构来改善血液循环。（A）损伤软组织上胶原蛋白的Van Gieson染色。（B）使用抗体荧光检测对软组织切片上暴露的胶原蛋白三维结构进行荧光成像。（C）CK对胶原蛋白HYP含量的影响。（D）胶原蛋白的提取和SDS-PAGE分离。（E）大鼠、小鼠和人类胶原蛋白α1链代表性肽段的序列比对。（F）CK对大鼠软组织总羟基化修饰数影响的蛋白质谱分析。（G）脯氨酰羟基化修饰的代表性肽MS/MS谱的鉴定。（H）损伤软组织VWF胶原的免疫组织化学分析。CK对软组织损伤大鼠血液参数的影响，包括RBC聚集指数（I）、HCT（J）、PLT（K）和MPV（L）。与对照组相比，#P<0.05，###P<0.01，###P<0.001；与mod组（n=6）相比，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

软组织中HYP含量的分析显示，mod组和con组之间没有显著差异。然而，CK导致胶原羟基化明显减少。这是由于CK对PHD2的抑制作用，从而导致胶原蛋白的变化（图6C）。为了验证这一假设，我们按照Birkedal-Hansen方法从受伤的软组织中提取了I型胶原蛋白。SDS-PAGE获得了初级胶原带和α1链（图6D）。比对分析表明，α1链在物种（大鼠、小鼠和人类）之间具有高度的序列同源性（图6E）。我们进行蛋白质质谱以确认每个酶水解组之间的羟基化差异。图6F显示，mod组的胶原α1链羟基化水平高于正常组织，而CK有效地抑制了其产生。例如，与con或CK组相比，肽片段GFPGADGVAGPK在mod组中显示出特定的羟基化Pro485信号，表明Pro485中添加了额外的16 Da m/z（图6G）。

此外，免疫组织化学分析显示，在mod组中，VWF（伪绿色）和胶原蛋白（伪红色）的合并黄色信号增强，药物干预组显著减少了胶原蛋白的暴露现象，如图6H所示（左图）。NAC的给药通过减轻局部出血有效地减弱了VWF的释放，导致荧光共定位减少。不同的是，CK阻碍了VWF和胶原蛋白之间的粘附，也导致Pearson系数值降低（图6H，左图）。最后，我们通过监测血液指标来评估血液循环的改善，包括红细胞聚集指数、红细胞压积（HCT）和血小板计数（PLT）（图6I-K）。正如预期的那样，mod组的所有这些参数都增加了，这表明血液循环紊乱、血液粘度升高和血小板聚集增强。此外，我们发现平均血小板体积（MPV）异常（图6L）。然而，CK通过缓解循环问题和抑制局部血栓形成来改善这些血液指标。

7. CK通过抑制血小板粘附缓解小鼠DIC

为了进一步验证靶向PHD2在血小板血栓形成中的关键作用，我们利用LPS诱导的小鼠DIC模型来评估肺组织中的尾出血和血栓形成。在图7A中，我们对各组小鼠尾部出血的调查显示，mod组因严重DIC导致的出血显著减少。然而，用ASP和不同剂量的CK（10、20和40mg/kg）改善了出血。图7B和C通过量化出血时间和出血量提供了额外的证据。Masson（图7D）和H&E染色（图7E）对肺组织进行的组织病理学分析也显示，每个处理组的血栓形成改善程度不同。凝血酶活化程度是血栓形成的关键标志物，CK干预后，凝血酶活化程度呈剂量依赖性提高（图7F），纤维蛋白原转化为纤维蛋白（图7G）。此外，VWF胶原定位评估显示，mod肺组织内血栓位置存在显著重叠。然而，CK成功地破坏了VWF胶原的定位，减少了血栓形成（图7H）。结果表明，CK可以预防VWF与胶原的相互作用，减少血小板粘附，阻碍血小板血栓形成的初始阶段。

图7 CK在小鼠DIC模型中抑制肺血栓。（A）DIC模型中小鼠尾部出血图示。（B、C）测量出血时间和出血量。（D）Masson染色和（E）H&E染色用于肺组织病理分析。（F，G）凝血酶和纤维蛋白原的免疫荧光分析。（H）肺中VWF和胶原蛋白的荧光共定位分析。与对照组相比，##P<0.01，###P<0.001；与mod组（n=6）相比，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

8. 靶向PHD2为抑制血栓提供了一种新的解决方案

为了研究靶向PHD2在血小板聚集中的作用，我们使用了三种PHD2抑制剂Dap、Rox和Vad，它们已被临床批准用于治疗慢性肾病患者的症状性贫血。所有这些化合物的结构组成都模仿了PHD2底物的天然辅因子2-OG。分子对接分析揭示了抑制剂与PHD2催化袋之间的相互作用，其中Fe（II）与2-His-1-Asp残基的三联体（H374、H313和D315）配位，分别显示出-6.8、-8.7和-8.1 kcal/mol的结合亲和力（图8A）。市售抑制剂IOX2也表现出相同的效果（-8.4千卡/摩尔）。随后，我们进行了一项研究，以评估这些抑制剂对血小板粘附的影响，并通过量化剩余的2-OG底物间接测量了PHD2活性。结果表明，所有抑制剂以及CK（1μmol/L）均能有效降低血小板粘附（图8B），未观察到显著差异。在评估PHD2活性时，CK与抑制剂的效果没有差异，而Dap在抑制剂中表现出更优的抑制作用，因此被选为进一步研究的对象（图8C）。

图8 sh-Phd2小鼠的构建证实，Phd2是抑制血小板粘附和血栓的潜在靶点（A）PHD2抑制剂Rox、Vad、Dap和IOX2与PHD2蛋白的分子对接，虚线表示催化口袋。（B）PHD2抑制剂对血小板粘附的影响；ns，多重比较检验无显著性（n=3）。（C）PHD2抑制剂存在下PHD2酶活性的测定和分析。与对照组相比，##P<0.01，###P<0.001；与mod组相比，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；△Dap组与Rox组比较差异有统计学意义（n=3）。（D）sh-Phd2敲除小鼠的构建方案。（E）免疫印迹分析用于评估sh-PHD2组中PHD2的敲除效率。与对照组相比，**P<0.01（n=3）。（F，G）DIC模型小鼠尾部出血时间和出血量的测定。（H）Masson染色用于肺组织血栓分析。（I，J）纤维蛋白原和凝血酶免疫荧光分析统计。（K）肺组织中VWF和胶原的荧光共定位分析。与对照组相比，##P<0.01，###P<0.001；与mod组相比，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；与sh-Phd2组中的mod组相比，△P<0.05，△△P<0.01，△△△P<0.001（n=6）。

为了确定PHD2在血小板血栓形成中的作用，我们制备了靶向肺组织的sh-PHD2敲除小鼠（图8D）。经过两周的干扰后，sh-Phd2组的Phd2表达显著降低了约60%（图8E）。图8F和G比较了LPS诱导的小鼠DIC模型中sh-con和sh-Phd2组的尾部出血时间和出血量。实验表明，在接受LPS处理后，sh-con组的尾部出血明显减少。然而，sh-Phd2组表现出明显增强的出血反应，从而阻碍血栓形成。当用Dap（10mg/kg）处理PHD2敲除小鼠时，与sh-con组相比，抗血栓治疗效果也降低了。

已经观察到，Dap和PHD2的敲除都显著改善了肺血栓的形成。我们通过Masson结合H&E染色对肺组织进行病理分析证实了这一点（图8H和支持信息图S3）。免疫荧光试验通过纤维蛋白原和凝血因子凝血酶进一步证实了这一发现（图8I和J）。此外，对VWF胶原定位的评估显示，sh-con-mod组存在实质性重叠。然而，抑制剂和sh-Phd2组都破坏了VWF胶原蛋白的共定位，从而减少了肺血栓的形成（图8K）。上述结果在CK干预sh-Phd2小鼠模型中也得到了证实（支持信息图S4）。迄今为止收集的证据表明，靶向PHD2在血小板血栓形成中起着至关重要的作用。

9. PHD2抑制剂联合ASP增强抗血栓作用

此外，我们还研究了PHD2抑制剂联合抗血栓药物对FeCl3诱导的颈动脉模型的影响。图9A显示，FeCl3刺激显著诱导颈动脉形成严重闭塞血栓。与模型组相比，干预组的血栓形成明显减少。血栓湿重（图9B）和长度（图9C）的测量表明，ASP、CK和Dap，无论是单独使用还是联合使用，都表现出良好的抗血栓作用。此外，与单独使用相比，ASP和CK的联合使用显示出更优的疗效，Dap和ASP的联合使用也观察到了类似的效果。

图9 PHD2抑制剂联合ASP对FeCl3诱导的动脉血栓形成的影响。（A）闭塞性颈动脉血栓图像。（B）PHD2抑制剂联合ASP对血栓湿重和（C）血栓长度的影响。（D-G）血浆中关键凝血参数的分析，包括PT、APTT、TT和FIB。（H）Masson染色分析动脉血栓组织病理学。与对照组相比，###P<0.001；与mod组相比，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；△P<0.05，△△P<0.01，△△△P<0.001，与各自的单药处理组（n=6）相比。

图9D-G中代表性凝血指标的结果，包括凝血酶原时间（PT）、活化部分凝血活酶时间（APTT）、凝血酶时间（TT）和纤维蛋白原（FIB），表明血栓的存在显著降低了PT、APTT和TT，同时增加了FIB含量。与mod组相比，所有治疗组均有所改善。图9H中血栓的Masson染色显示，mod组存在明显的动脉内膜损伤和致密结构，导致严重的闭塞性血栓。然而，干预组的内膜损伤较小，血栓结构松散，血栓表面积显著减少。总之，CK或PHD2抑制剂与阿司匹林联合使用对血栓形成的治疗效果比单独使用更明显，为治疗血栓形成提供了见解。

血小板在止血和血栓形成过程中起着至关重要的作用。血小板的受控活化和聚集对于在血管损伤部位实现止血至关重要。然而，不受控制的血小板活化会导致病理性血栓的形成，从而导致DIC、心肌梗死和中风等循环系统疾病。抗血小板治疗的当前靶点如图10A所示。临床实践中使用的抗血小板药物主要有四类，单独或联合使用，针对血小板活化的不同途径，这些包括环氧化酶1（COX1；也称为PTGS1）抑制剂，如阿司匹林，ADP P2Y12受体抑制剂，如氯吡格雷、普拉格雷和替卡格雷，PAR1拮抗剂，如沃拉帕沙，以及GPIIb/IIIa抑制剂，如阿昔单抗、依替巴肽和替罗非班。西洛他唑是另一种经美国食品药品监督管理局批准的抗血小板药物，可改善外周血管疾病，降低与动脉血栓形成相关的发病率和死亡率。尽管这些药物是有效的，但它们会引起出血风险，可能导致胃溃疡、长期出血、再生障碍性贫血和血小板减少性紫癜。此外，很大一部分人口对这些药物产生了耐药性，因此需要开发更安全、更有效、副作用最小的治疗方法。近年来，在临床前和早期临床试验中出现了几种创新的抗血小板疗法，证明了在保持止血的同时抑制血栓形成的潜力。这些治疗靶点磷酸肌醇3-激酶β（AZD6482），蛋白质二硫键异构酶（ML359），通过内向信号调节激活GPIIb/IIIa（RUC-4，scFv）。针对血小板GPVI介导的粘附途径的抑制剂（9O12.2，revcept）表明，抑制血小板与胶原蛋白的粘附与随后的血小板活化密切相关。

图10 通过调节胶原蛋白三维结构实现抗血小板粘附的示意图。（A）抗血小板血栓形成的靶点与当前研究。浅红色阴影表示临床批准的药物靶点，深红色突出显示表示新出现的策略，蓝色表示本文中照亮的胶原蛋白靶点。（B）该机制图针对PHD2蛋白调节胶原蛋白的三维结构，以抑制血小板粘附。

在血小板血栓形成过程中，血小板胶原受体如GpVI、α2β1或GpIb/VWF复合物与内皮下胶原结构之间的相互作用对于形成阻塞血管系统的富血小板血栓至关重要。最近，人们开始转向创新的治疗靶点，特别关注靶向GPIb-VWF轴的抑制剂。GPIb-IX-V复合物通过GPIb亚基在血管损伤部位与VWF结合，GPIb亚单位与胶原蛋白结合，从而引发血小板粘附和血栓形成。研究者已经开发了多种靶向GPIb-VWF轴的抑制剂，包括抗GPIb或抗VWF抗体、来源于蛇毒的GPIb拮抗剂以及GPIb或VWF的重组片段。然而，由于使用它们会增加出血的风险，一些开发工作已经停止。此外，胶原蛋白的三维结构也对其与VWF的相互作用产生了重大影响，然而这一关键方面在相当长的一段时间内被忽视了。

近年来，通过运用传统智慧阐明中药活性成分背后的机制，开发创新药物的趋势日益明显。在这项研究中，我们发现三七总皂苷中的CK在改善血小板粘附功能障碍方面起着关键作用（支持信息图S5），同时预测PHD2是一个关键的治疗靶点。本文的见解强调，通过抑制脯氨酸羟基化来抑制VWF与胶原的相互作用，从而靶向胶原的结构框架，可能为预防血小板血栓形成提供一种替代解决方案（图10B）。

以前的PHD2抑制剂药物靶向催化袋，Rox（IC50=117.2 nmol/L），Vad（IC50=256.9 nmol/L）和Dap（IC50=140.8 nmol/L），主要靶向HIF-1α信号通路以稳定HIF-α并增强EPO表达，主要用于贫血等疾病，然而之前研究者们对PHD2参与胶原羟基化的研究有限。一些抗血小板药物生产者仅专注于评估胶原蛋白水凝胶在伤口敷料中的应用。因此，我们的研究拓宽了临床批准的PHD2抑制剂的潜在治疗应用，其可能成为解决血小板凝集和维持循环稳态的潜在候选药物，PHD2抑制剂在治疗动脉粥样硬化方面显示出有前景的效果，详见支持信息（支持信息图S6和S7）。此外，分子对接表明，CK不仅竞争性靶向PHD2的催化袋，而且占据底物结合袋，涉及特定的氨基酸残基（T236、I256、W258和M299）；CK的IC50值约为209.8 nmol/L（支持信息图S8），这些信息可能为靶向PHD2结构的药物设计提供有价值的参考。尽管VWF与内皮下胶原的结合已被阐明，但通过胶原脯氨酰羟基化控制血小板粘附和聚集形成活化的精确机制仍然难以全面理解，需要进一步研究。

结论

靶向抑制PHD2以减弱胶原羟基化并随后阻止VWF与胶原的结合，是一种潜在的创新抗血小板策略，可有效预防病理性血栓形成，同时改善血液循环系统疾病。然而，本文提出的新型抗血小板治疗范式需要在临床实践中进一步评估。对血栓形成和抗凝机制的理解不断深入，将为扩大患者群体提供安全有效的药物。

https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2211383524004957

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