《ACS Nano》四川大学王启光/樊渝江：包裹生菌膜小泡水凝胶中促进伤口血管化！

大家好，今天分享一篇发表在ACS nano上的文章，题目为“Anchoring of Probiotic-Membrane Vesicles in Hydrogels Facilitates Wound Vascularization”。文章的通讯作者是四川大学王启光副研究员和樊渝江教授，王启光主要研究方向有软骨缺损的再生修复材料与人工细胞的仿生构建等；樊渝江教授主要研究方向：基于3D打印技术的生物活性材料在骨骼（颅颌面、脊椎、关节等）再生修复中的应用；细胞来源外泌体在骨关节炎治疗中的应用及产品开发，生物医用高分子填充及辅料产品研究；装载药物、基因以及生物活性成分的高分子靶向传递系统开发等。

血管化是伤口愈合中的一个关键过程，促进新血管网络的形成，为组织重塑和修复提供必需的营养。早期阶段的快速血管化显着影响组织再生，并影响免疫调节、细胞繁殖和迁移等有益过程，它们共同提高了愈合质量。因此，血管形成已成为治疗效果的关键指标。最近的研究强调了益生菌在伤口愈合中的功效，特别是通过调节炎症、促进血管生成和帮助组织再生。而且益生菌可以释放有机酸、外来体、酶等生物活性分泌物。

作者之前的研究还证明了罗伊氏乳杆菌在伤口修复中的成本效益和实用性。然而，由于益生菌的免疫原性及其在接触体液时引起额外炎症的可能性，从益生菌中提取活性成分提出了一种新的策略。有趣的是，细菌，就像其他细胞一样，释放可以影响各种生物过程的膜囊泡（MV）。细菌MV的产生具有成本效益且在不同温度下稳定，使其有利于生物制药应用。目前，细菌MV可安全地用作疫苗佐剂和天然疫苗。因此，可以合理地假设源自L. reuteri可能提供一种更安全的替代方案，具有保留伤口愈合能力。这种方法可能在组织修复生物材料的开发中更具竞争力。目前，细菌MV可安全地用作疫苗佐剂和天然疫苗。因此，作者可以合理地假设源自L. reuteri可能提供一种更安全的替代方案，具有保留伤口愈合能力。这种方法可能在组织修复生物材料的开发中更具竞争力。

水凝胶具有类似于细胞外质（EM）的独特三维网络结构，在伤口愈合期间提供支持和保护，并作为将治疗剂输送到损伤部位的平台。作者从罗伊氏菌（LMV）并使用N-羟基丁二醇二胺（NHS）-马来酸（MAL）作为介体将它们锚定到羟化壳聚糖（CS）中，以构建用于血管生成和伤口修复的益生菌-MV水凝胶（Gel-LMV）（方案1）。LMV保持了增强细胞增生和血管生成的能力，而不会诱导额外的炎症。一旦整合到水凝胶中，LMV就会与凝胶的降解同步以受控的方式释放，通过调节关键信号途径（包括缺氧诱导因子1（希夫-1）途径）促进人脐静脉内皮细胞（HUVECs）的血管形成。体内研究证实，Gel-LMV在伤口愈合早期有效促进血管新生，并增加人血管内皮细胞粘附分子（CD 31）的表达，加速愈合过程。这项研究为设计基于益生菌MV的生物材料提供了一种先进的策略，以增强伤口愈合应用。

LMV的合成与特性

大规模培养罗伊氏菌，并分离上清以进一步加工（图1A）。为了探索LMV的潜在生物学能力，在本研究中进行了mRNA测序转录组。LMV参与调节“MEK信号途径”、“Rap 1信号途径”和“希夫-1信号途径”。这些发现表明，LMV在促进伤口愈合方面具有显着优势，特别是通过促进血管生成。因此，作者将一组靶基因与参与伤口修复的基因杂交，以获得共同的基因集（图1F）。基于这些共享基因及其在LMV中相应的mRNA表达水平，作者确定了前10种高表达的mRNA，并具有许多相应的靶点（图1G）。最后，为这些靶基因构建了基因相互作用网络（图1H），揭示了潜在的枢纽基因，例如成纤维细胞生长因子2（GF 2）、血管内皮生长因子A（VEGFA）和血小板源性生长因子亚基（BPDGFB）等。为了评估LMV对细胞行为的影响，为体外细胞实验建立了一系列LMV浓度梯度（图1 I），并使用BCA方法量化LMV的浓度。为了关注应用中的生物安全性，确定HUVECs和L929细胞促进细胞繁殖的最大浓度为20 μg/mL（图1 J）。

图1

Gel-LMV的合成与特性

凝胶水凝胶是通过CSC和氧化透明质酸（OHA）之间的希夫碱反应合成的，具有合适的三维网络结构和生物相容性。作为对照，通过物理复合合成负载LMV的凝胶水凝胶（凝胶/LMV），水凝胶合成中LMV的最佳浓度为20 μg/mL。LMV的修饰没有显着改变凝胶的原始结构（图2B）或流体动力学（图S11），也没有影响降解行为（图2C）。共焦显微镜显示Gel-LMV内LMV的均匀分布和增强的加载效率（图2D）。LMV组的延长释放证实了LMV成功移植到GelLMV中的水凝胶上（图2 E）。

图2

Gel-LMV在体外减弱血管形成和增生

在评估Gel-LMV的潜在性能时，作者描述了水凝胶对体外细胞行为的直接影响，包括增生、迁移和管状形成（图2F）。如图2G所示，凝胶显示出良好的生物相容性，但没有细胞毒性，尽管其显着促进细胞增生的能力有限且与对照组相当。然而，当LMV锚定在凝胶上时，与单独的凝胶相比，Gel-LMV可以在更长的时间内有效地促进细胞繁殖。作为伤口愈合期间表皮再生的模型，划痕伤口愈合试验表明，Gel-LMV诱导更多细胞迁移到水凝胶的位置，表明其有潜力促进水凝胶插入部位的组织再生（图2 H）。此外，Gel-LMV保持了持久的生物相容性，促进细胞繁殖（图3A、B）。在细胞划痕模型中，L929细胞在24小时时GelLMV的闭合率超过60%（图3C）。此外，用于评估血管形成能力的材料胶管形成试验表明，与凝胶处理的HUREC相比，Gel-LMV的总节段长度 显着更高（图3D）。在迁移试验中，HUREC的Gel-LMV的闭合率也超过了70%（图3E）

图3

为了揭示Gel-LMV如何影响细胞活性的潜在机制，在与HUVECs共培养3天后进行了RNA测序。主成分分析表明，Gel和Gel-LMV之间的基因表达存在显着差异，GO分析表明，Gel-LMV中上调的基因与细胞增生、迁移和生长因子表达相关，与LMV的作用密切一致（图4A）。下调的基因表明细胞死亡减少（图4 B）。KEGG分析表明，相关途径的调节集中在对血管形成积极的活动上，例如希夫-1信号途径、糖分解/糖异生和碳代谢（图4C）显示了特定基因热图和基因途径相互作用弦图（图4D、4 E），以及与血管再生相关的基因表达，包括磷酸果苷酶（PFKL）、阿卜杜拉酶A（ALDOE）、磷酸丙糖同工酶（TIP）等，已识别（图4F）。为了进一步证实Gel/LMV在血管生成相关途径中的调节作用，用KC 7 F2抑制了希夫-1信号途径。与单独使用GelLMV相比，Gel-LMV的血管新生能力显着降低，证实了该途径的重要性（图4 H）。总而言之，这些结果表明Gel-LMV有潜力通过调节关键信号途径中的基因表达来增强血管生成和其他再生生物学活性。

图4

Gel-LMV体内治疗全层皮肤损伤模型

图5

本研究介绍了L.将罗伊氏菌膜小泡（LMV）转化为新型益生菌-MV水凝胶，通过将LMV化学嫁接到水凝胶网络中来实现。LMV的生物活性在水凝胶中得到有效保留，确保持续控制释放并促进基因调节剂的分泌，从而增强细胞的繁殖、迁移和血管生成。这最初是通过转录组分析确定的，并在体外进一步验证。与传统商业应用相比，益生菌-MV水凝胶表现出更好的血管化能力，导致伤口部位的皮肤组织显着再生。总体而言，该策略为开发益生菌MV作为促进血管生成的潜在治疗方法提供了宝贵的见解，并扩大了益生菌MV的生物医学应用。

DOI: 10.1021/acsnano.4c11986

原文链接：https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acsnano.4c11986