《食品科学》：荆楚理工学院李蓉博士等：基于转录组学探究高糖饮食诱导秀丽线虫衰老的分子机制

随着生活水平的提高，人们饮食中摄入的糖含量越来越高，糖的过量摄入不仅会增加肥胖、糖尿病及心血管疾病等的患病风险，且持续的高血糖会导致人和动物的死亡。秀丽线虫（以下简称线虫）作为研究衰老的经典模型，由于其饮食结构单一、生命周期短，因此在其常规的食物大肠杆菌中添加一定量的葡萄糖，可以较好地排除其他影响因素模拟人类高糖饮食带来的影响，且目前的研究已经表明与哺乳动物类似，高糖饮食会对线虫生长发育、代谢、应激抗性、寿命等产生不良影响。

荆楚理工学院农业生物技术研究所的李蓉、徐艳，湖北省农业科学院农业质量标准与检测技术研究所陶明芳*等利用转录组学技术探究高糖处理后线虫整体基因表达谱的变化，并对差异表达基因进行GO和KEGG分析，全面归纳差异基因涉及的相关信号通路，以期为深入研究高糖饮食对衰老影响的分子机制奠定基础。

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高糖饮食诱导的线虫衰老

根据本课题组前期的研究，在饮食中添加葡萄糖可以导致线虫寿命缩短，其中质量分数为1%、2%、4%的葡萄糖会分别导致线虫寿命缩短14.58%、22.22%、31.50%，其中4%葡萄糖由于浓度太高，会使线虫表皮皱缩出现异常，因此本实验选择2%葡萄糖添加量诱导。此外，研究表明添加2%葡萄糖后，线虫的表型例如吞咽率、弯曲摆动频率等也出现不可逆的下降，表明高糖加速了线虫健康表型的衰退。基于高糖对线虫寿命及健康表型的影响，通过转录组测序进一步探究高糖诱导线虫衰老的分子机制。

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RNA质控结果

使用Illumina高通量测序平台测定了6 个样品，其中对照组3 个、高糖饮食组（HG）3 个，每个样品平均产生6.5 Gb数据。如表2所示，所有样本RNA质量均大于1 μg，且6 个样本的OD 260nm/280nm 均大于1.80，表示所有样本提取的RNA无蛋白质等杂质污染，OD 260nm/280nm 在2.1～2.6之间表示样本RNA无有机试剂污染。此外，RNA完整性指标（RIN）值≥7.0表示符合要求，而6 个样本RIN值均大于9.0，综上，样本提取的RNA满足建库要求。

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测序数据质控分析

对测序产生的数据进行质控分析，如表3所示，将样本的原始数据去接头、去低质量后得到Clean reads，其Q30均大于99%，GC含量在48.91%～49.46%之间，表明碱基分布均匀，测序准确度高。为了保证序列的质量及后续表达量的计算更加准确，基于文库扩增之前每一条RNA片段上的身份标签（unique identifier，UID）去重得到的结果如表3所示，经过UID去重的reads占解析到的UID reads百分比（UID2）均大于88%，说明获得了高质量的质控数据用于后续分析。

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参考序列比对

将去重后的Clean reads与参考基因组Caenorhabditis elegans（assembly WBcel235）进行比对，结果如表4所示，所有样本的比对率均大于97%，且有唯一比对位置的序列所占百分比均大于95%，分别比对到参考基因组上的正链序列数目、负链序列数目百分比均为50%，表明各样本比对效率较高，测序结果可靠。

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差异表达基因统计

使用RSEM表达定量软件对转录本的表达水平进行定量分析。以对照组和高糖组间表达量差异倍数（FC）≥2.0、P＜0.05为标准筛选出差异表达基因。图1为差异表达基因火山图，经过统计发现相对于对照组，高糖处理组共有4183 个显著差异表达基因，其中显著上调基因1327 个，显著下调基因2856 个，这些基因主要与线虫生长、代谢、衰老、应激抗性等有关。

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差异表达基因GO功能富集分析

采用Goatools软件对差异表达基因进行GO富集分析，P＜0.05表明富集的GO功能具有显著性，按照显著性程度显示排名前20的富集结果。如图2所示，高糖处理后线虫差异表达基因在未折叠蛋白反应、压力应激响应、衰老、自噬、转移酶活力、催化酶活力、热休克蛋白连接、成虫寿命、端粒维持等方面显著富集。本课题组之前的研究表明，高糖饮食会降低线虫寿命且会降低线虫体内超氧化物歧化酶活力和还原型谷胱甘肽水平，本研究结果从差异基因GO功能富集方面进一步解释了出现上述现象的原因。

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差异表达基因KEGG通路富集分析

为了系统地了解基因的相关功能与作用通路，通过KEGG通路富集分析可以明确差异表达基因参与的最主要的代谢和信号转导途径。图3显示了高糖处理组差异表达基因富集排名前20 条的信号通路。高糖处理组差异表达基因富集最显著的通路是线虫寿命调节途径，表明高糖确实能够显著影响线虫的寿命，这与Xiong Ligui等和Choi的研究结果一致，其报道高葡萄糖饮食显著降低了线虫的寿命。此外，差异表达基因在自噬调节、丙酮酸代谢、FOXO信号通路、糖酵解/糖异生、谷胱甘肽代谢、转化生长因子-β信号通路上也显著富集。已有研究报道显示，高葡萄糖饮食会通过下调DAF-16/FOXO的活性缩短线虫的寿命，DAF-16是哺乳动物叉头转录因子FOXO的同源蛋白，在线虫衰老和生长发育过程中起着重要的调控作用，而本研究结果与上述结论一致，即高糖处理组差异基因在FOXO信号通路显著富集。

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差异表达基因real-time PCR验证

为了验证转录组数据的可靠性和准确性，选择与对照组相比差异表达显著的基因，参照qPrimerDB-qPCR Primer数据库中最优引物序列合成引物进行定量分析，结果如图4所示。转录组测序数据中，高糖处理组线虫daf-2、akt-2、age-1、argk-1、fat-6的表达量分别上调1.38、1.32、1.51、8.50、3.25 倍，利用real-time PCR对上述5 个基因表达量进行验证，高糖处理组线虫daf-2、akt-2、age-1、argk-1、fat-6的表达量分别为对照组的2.09、1.46、1.61、2.46、4.47 倍，与转录组测序结果一致。其中，daf-2、akt-2、age-1均为线虫胰岛素信号通路上游的基因，其表达上调表明胰岛素信号通路被激活。有研究报道抑制daf-2的表达会使线虫的健康寿命延长，显著提高其运动活力，而daf-2上调会导致AGE-1/PI3K的招募和激活，随后被激活的AGE-1/PI3K通过磷酸化3-磷酸肌醇依赖激酶1调节Akt激酶和丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶的活性，最终导致转录因子DAF-16/FOXO滞留在细胞质中，对线虫的氧化应激抗性、未折叠蛋白反应、转移酶活性等均会造成不利影响。此外，daf-2还可以通过调节bec-1的表达调控自噬，本研究GO功能富集分析中高糖组差异基因也在自噬方面显著富集，与上述报道结果一致。有研究报道胰岛素信号通路激活会导致线虫寿命缩短，因此，本研究结果表明高糖会通过激活胰岛素信号通路从而缩短线虫的寿命。此外，argk-1作为哺乳动物中肌酸激酶的同源基因，维持ATP的平衡，其通过调控下游的腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）信号通路从而调节线虫衰老进程，这与GO分析中差异基因在成虫寿命显著富集结果一致。本研究结果显示高糖处理会上调argk-1的表达，意味着高糖饮食可能会通过调控能量代谢途径AMPK信号通路调节寿命。在线虫体内，fat-6编码硬脂酰辅酶A-9去饱和酶，催化硬脂酸转化为油酸，调节线虫脂类代谢和生长发育，其与线虫脂肪的合成有关。有报道指出胰岛素信号通路下游包括fat基因家族在内的靶基因会影响脂肪酸去饱和脂肪分解、酰基辅酶A和醇脱氢酶的活性、乙醛酸循环调节因子和自噬调节因子等。而本研究结果也显示高糖处理会导致线虫体内fat-6上调，KEGG富集分析也显示高糖处理组差异表达基因在自噬调节、丙酮酸代谢、FOXO信号通路方面显著富集。高糖饮食会导致线虫体内的脂肪含量升高，本研究结果表明高糖会导致线虫体内fat-6表达显著提高，从而有利于线虫体内脂肪的合成。

此外，转录组测序数据显示，高糖处理下调了线虫ctl-1、ugt-9、hsp-12.3、gst-35、mtl-1的表达，而PCR分析中高糖处理组线虫ctl-1、ugt-9、hsp-12.3、gst-35、mtl-1的表达结果与转录组测序结果一致。其中，ctl-1和mtl-1是线虫中转录因子DAF-16下游的靶基因，分别与过氧化氢酶活性调控和对金属离子的应激响应有关。本研究结果显示高糖饮食会显著降低ctl-1和mtl-1的表达，从而导致线虫体内抗氧化酶活力下降，这也从侧面证实GO功能分析中高糖处理组线虫差异表达基因在转移酶活力和催化酶活力方面显著富集。此外，hsp-12.3编码热休克蛋白受DAF-16的调控，参与线虫对热应激的抗性，而gst-35编码谷胱甘肽S-转移酶参与谷胱甘肽代谢过程，维持机体的氧化还原稳态。本研究结果显示，高糖显著下调了hsp-12.3和gst-35的表达，推测高糖饮食会降低线虫对外界热应激和氧化应激的抗性，而GO功能分析与KEGG通路富集分析中高糖处理后线虫差异表达基因分别在压力应激响应、热休克蛋白调节、谷胱甘肽代谢信号通路方面显著富集。此外，ugt-9编码UDP-葡萄糖醛酸转移酶参与解毒反应，在衰老线虫中表达降低，在长寿型DAF-2缺失突变体中表达显著上调，不仅与糖代谢有关，而且与衰老调控有关。本研究表明高糖会通过下调ugt-9的表达抑制线虫的解毒反应，从而促进其衰老。

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结论

本研究利用转录组学技术分析了高糖处理对线虫整体基因表达谱的影响，通过对差异表达基因进行GO功能富集和KEGG富集分析发现，高糖饮食会对线虫的衰老、压力应激响应、转移酶活力、谷胱甘肽代谢、糖酵解/糖异生、自噬调节等方面产生显著的影响。此外，通过测定相关差异基因的表达进一步证实，高糖通过调控与胰岛素信号通路有关的基因、热休克蛋白基因、氧化应激相关基因、脂肪合成基因等的表达调节线虫的寿命、应激抗性和糖脂代谢。本研究通过解析高糖饮食对线虫衰老及代谢相关基因表达谱的影响，明确了高糖饮食可能的作用靶点，可为深入研究高糖饮食对人体衰老及代谢产生的不利影响提供理论依据。

本文《基于转录组学探究高糖饮食诱导秀丽线虫衰老的分子机制》来源于《食品科学》2023年45卷第11期24-30页，作者：李 蓉，徐 艳，缪园欣，陶明芳*。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20230904-023。点击下方阅读原文即可查看文章相关信息。

实习编辑：天津商业大学 梁雯菁，责任编辑：张睿梅。点击下方阅读原文即可查看全文。图片来源于文章原文及摄图网。

为深入探讨未来食品在大食物观框架下的创新发展机遇与挑战，促进产学研用各界的交流合作，由北京食品科学研究院、中国肉类食品综合研究中心及中国食品杂志社《食品科学》杂志、《Food Science and Human Wellness》杂志、《Journal of Future Foods》杂志主办，西华大学食品与生物工程学院、四川旅游学院烹饪与食品科学工程学院、西南民族大学药学与食品学院、四川轻化工大学生物工程学院、成都大学食品与生物工程学院、成都医学院检验医学院、四川省农业科学院农产品加工研究所、中国农业科学院都市农业研究所、四川大学农产品加工研究院、西昌学院农业科学学院、宿州学院生物与食品工程学院、大连民族大学生命科学学院、北京联合大学保健食品功能检测中心共同主办的“第二届大食物观·未来食品科技创新国际研讨会”即将于2025年5月24-25日在中国 四川 成都召开。

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