华东地区猫杯状病毒的分离鉴定及遗传进化分析

作者：程松

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摘要

为了解猫杯状病毒（FCV）在中国华东地区的流行状况及其遗传变异和演化特性，本研究采集30份疑似感染FCV的猫眼鼻拭子，通过常规方法分离鉴定出9株FCV，经RT-PCR和测序获得了FCV VP1的基因序列，与文献报道的流行株、高致病力FCV(VS-FCV)株和疫苗株VP1基 因同源性进行比较及遗传进化分析。结果显示，9株华东地区分离株VP1基因核苷酸序列同源性为70.9%~93.3%，分离株与流行株VP1基因核苷酸和氨基酸序列同源性分别为66.9%~84.8%和78.0%~91.9%，且大部分分离株与国内流行株处于同一分支；与VS-FCV VP1基因核苷酸和氨基酸序列同源性分别为73.9%~80.3%和82.2%~89.8%，其中只有FCV AH1分离株与VS-FCV-5株处于同一分支；与国内疫苗株VP1基因核苷酸和氨基酸序列同源性分别为73.9%~80.3%和82.2%~89.8%，其中只有FCV AH1株与国内疫苗株Vaccine-FCV-D90357处于同一分支。以上结果首次表明，华东地区FCV不断发生变异，是导致传统疫苗不能达到很好的免疫保护的原因。本研究丰富了中国FCV的流行病学资料，为FCV疫苗研发提供了参考。

关键词：猫杯状病毒；分离鉴定；VP1；序列同源性；遗传进化

正文

猫杯状病毒（Feline calicivirus，FCV）是一种感染猫的常见病原体，属于杯状病毒科水疱疹病毒属[1]。FCV的基因组是一种单股正链RNA，全长约7.8 kb，编码3个开放阅读框 (ORF) ，分别编码非结构蛋白(ORF1)、VP1主要衣壳蛋白(ORF2)和VP2次要衣壳蛋白(ORF3)。其中，90个VP1二聚体组成病毒的二十面体衣壳，每个VP1单体都有3个结构域：一个N端臂(NTA)、一个壳层(S)域和一个由P1和P2子域组成的突起(P)域，P2子域包含预测与受体相互作用的氨基酸，并且是最易变的[2]。这种变异主要位于aa426~aa521，该区域被称为高变区，最能反映出FCV的遗传演化特征[3-6]。

经典FCV主要引起猫的上呼吸道感染，主要表现为口腔粘膜、齿龈、舌表面发生糜烂和溃疡，体温轻微升高、流鼻涕和上呼吸道症状，病死率很低，但感染率很高[7]。在多猫环境下，感染率可高达90%以上[8-9]。FCV是一种基因组容易发生变异的RNA病毒，这种变异不仅表现在抗原性方面，而且体现在致病性增强方面。临床上疫苗预防效果并不理想，尤其是与高致病性FCV的交叉免疫很少，导致临床上免疫失败频发[10]。FCV感染是目前临床上发病率最高的一种猫的传染病。由于FCV可以感染几乎所有的猫科动物，近年来越来越多的FCV在中国被不断分离和报道，2018年郭慧敏等首次报道了VS-FCV中国分离株[11]，其研究结果显示FCV在中国已经发生了明显的变异，出现了超强毒株，利用传统的FCV疫苗并不能对抗该病毒的感染，对中国FCV引起的疫病防控带来了新的难题。为了进一步了解FCV在中国的流行状况及其遗传变异和演化方向，本研究开展了华东地区FCV的分子流行病学调查，为中国FCV的流行病学以及新型FCV疫苗研究提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 主要实验材料

30份眼鼻拭子样品分别来自安徽、江苏和上海地区宠物医院就诊的具有上呼吸道症状的患猫。

猫肾细胞（Crandell feline kidney cells，CRFK）由上海兽医研究所小动物传染病预防与创新团队实验室保存。EMEM培养基和胎牛血清购自维森特上海技术（南京）有限公司；快速DNA连接试剂盒、DNA胶回收试剂盒、反转录试剂盒和高保真DNA聚合酶购自南京诺唯赞生物科技有限公司。

1.2 病毒的分离鉴定

将采集的样品采用pH 7.0的PBS缓冲液浸泡，获得的样品用 0.22 μm微孔滤膜过滤，-20℃保存备用。吸取400 μL上述处理的样品，提取总RNA，反转录合成cDNA作为模板，参照文献建立的RT-PCR方法进行扩增[5]。将PCR阳性样品接种单层CRFK细胞，置于37℃、5 % CO2孵育48 h~72 h，每隔12 h观察是否产生细胞病变（CPE）。如果出现CPE，将病变的细胞液反复冻融3次，分装到冻存管，保存于-80℃备用。

将分离病毒株接种CRFK细胞，待80%出现CPE后进行反复冻融3次收毒，8 000 r/min离心30 min，取上清12 000 r/min 4℃离心60 min，取沉淀，2%磷钨酸负染，电镜观察。

1.3 FCVVP1基因的扩增

参考GenBank中收录的FCV VP1基因序列（JN210885），设计FCV特异性扩增引物：F 5‵-ATGTGCTCAACCTGCGCTAAC-3‵/ R 5‵-TCATAATTTAGTCATTGAGCTCCT-3‵。引物由上海派生诺生物科技有限公司合成。提取CPE细胞培养物总RNA，反转录合成cDNA作为模板，利用FCV VP1特异性引物和高保真DNA聚合酶PCR扩增FCV VP1基因。PCR扩增条件为：95℃ 3 min；95℃ 1 min、58℃ 30 s、72℃ 2 min，34个循环；72℃10 min。同时设立无模板对照。将PCR产物纯化后用快速DNA连接试剂盒连接载体后测序，测序结果首先用NCBI中的BLAST工具进行比对分析，确认是否为FCV的VP1基因序列，然后分别参照国内FCV流行株、高致病力FCV株和FCV疫苗株，利用DNAStar软件对FCV VP1基因进行生物信息学分析。

2 结果与讨论

2.1 FCV的分离鉴定

采集疑似FCV感染的临床样品进行RT-PCR扩增，扩增产物经凝胶电泳检测显示在320 bp左右出现与预期目的产物大小一致的特异性条带，部分样品扩增结果见图1A，经过测序分析为FCV阳性。RT-PCR检出的9份阳性样品无菌处理后接种CRFK细胞，18 h后均产生了明显的CPE（图1B）。待80%出现CPE后，经电镜负染观察可见无囊膜，球形，直径约35 nm的病毒粒子（图1C），与杯状病毒粒子形态特征相符，证明分离的9株病毒为FCV，且分别命名为SH19-9、SH19-17、FCV SH2019、FCV AH1、FCV AN2、FCV AN3、FCV AN C、FCV TH1、FCV NJ-6-2。

图1 FCV分离鉴定

Fig. 1 Isolation and identification of FCV strains.

A: M: DNA Marker; 1 PCR product; 2: Negative;B: 1: Mock-infected CRFK cells; 2: The isolated FCV strain infected CRFK cells;C: Electron microscope image of isolated FCV strains

2.2 FCV VP1基因的扩增及序列测序

将9份FCV阳性病料样品接种于CRFK细胞，当产生80% CPE后，提取RNA，反转录得到cDNA，利用FCV VP1特异性引物进行PCR扩增，产物经琼脂糖凝胶电泳检测后得到约2000 bp大小的条带，与预期2007 bp大小相一致（图2）。测序结果拼接后，得到9株FCV VP1基因序列。

图2 FCV VP1基因的PCR扩增

Fig.2 PCR amplification of FCV VP1 gene;M: DNA Marker; 1: Negative; 2-10: PCR products

2.3 FCV VP1同源性及遗传演化分析

2.3.1华东地区分离株与国内流行株同源性及遗传演化分析

将9株FCV分离株VP1基因与国内FCV流行株VP1基因进行同源性分析。结果显示，9株华东地区分离株之间的核苷酸序列同源性为70.9%~93.3%，其中SH19-9株与SH19-17株同源性最高为93.3%，与国内的流行株同源性为66.9%~84.8%，其中FCV NJ-6-2株与吉林分离株CH-JL4的同源性高达91.9%，FCV SH2019株与湖北分离株WH5-71241C的同源性最低为66.9%，核苷酸序列的同源性差异较大。衣壳蛋白VP1基因编码的氨基酸序列分析结果显示，9株分离株与国内流行株之间的同源性为78.0%~91.9%，其中FCV AH3株与南京分离株FB-NJ-13的同源性高达91.9%，FCV SH2019株与湖北株WH5-71241C的同源性低，为78.0%。表明国内最近几年的FCV变异较大；分离株衣壳蛋白VP1的遗传进化树显示，SH19-9、SH19-17、FCV AN3与2013年吉林分离株CHJL和南京FB-NJ-13株处于同一分支，FCV AH2与2009年广东分离株GD处于同一分支，FCV AH C与武汉WH5-71241C株处于同一分支，FCV NJ-6-2、FCV TH1、FCV SH2019与吉林株CH-JL4和黑龙江株TFHLJ-8株处于同一进化分支（图3），具有相同的进化起源。其中，分离株FCV AH1与国内流行株有一定的差异，但其遗传关系与WZ-1株和GX01-13株较近，没有形成明显的独立的分支。上述结果表明从我国华东分离的9株FCV与国内FCV的流行株在时间和空间维度并没有明显的差异，遗传进化相对较小。

FCV isolated strains in East China

图3 华东地区分离株与国内流行株VP1基因遗传进化树

Fig. 3 Phylogenetic tree of VP1 gene of 9 isolated FCV strains in East China and the endemic strains in China

2.3.2 华东地区分离株与VS-FCV株同源性及遗传演化分析

将9株FCV华东分离株与VS-FCV株VP1基因进行同源性分析。发现9株华东地区分离的FCV与经典VS-FCV株核苷酸同源性为73.9%~80.3%，氨基酸同源性为82.2%~89.8%。其中核苷酸和氨基酸的同源性最高的是FCV AH1与VS-FCV-5株之间，分别为80.3%和89.8%。从核苷酸和氨基酸序列的同源性上并不能把经典FCV与VS-FCV株区分出来。系统进化树分析显示，SH19-9、SH19-17、FCV SH2019、FCV AN2、FCV AN3、FCV AN C、FCV TH1和FCV NJ-6-2分离株与VS-FCV株亲缘关系较远，并没有形成独立的分支。FCV AH1株与FCV-5属于同一分支，遗传关系较近（图4）。表明国内流行株还是以经典FCV株为主。但是近几年VS-FCV已在世界各国出现，2018年郭慧敏等首次报道了VS-FCV在我国流行[11]，最近我们又在安徽地区发现FCV AH1株与美国VS-FCV-5株属于同一分支，表明近几年VS-FCV在国内逐渐出现，并有进一步流行的潜在风险。

FCV isolated strains in East China

图4 华东地区分离株与经典VS-FCV株VP1基因遗传进化树

Fig. 4 Phylogenetic tree of VP1 gene of 9 isolated strains in East China and the classical VS-FCV strains

2.3.3 华东地区分离株与疫苗株遗传演化分析

FCV感染主要依靠疫苗免疫预防。目前商品化的疫苗通常是含F9和2024株弱毒疫苗，含FCV G1和FCV 431株灭活苗，还有把FCV F4 株ORF2 基因插入到猫疱疹病毒1 型（FHV-1）的活病毒载体疫苗。通过调查，目前国内主要使用的是含有F4、F9和2024株的疫苗。为了研究国内使用的疫苗是否对FCV具有良好的保护，将9株华东地区分离株与国内使用疫苗株的VP1基因进行同源性分析。结果表明，华东地区分离株与国内疫苗株VP1基因的核苷酸和氨基酸序列同源性分别为70.6%~76.8%和81.9%~87.9%，同源性较低，可能存在疫苗免疫失败的风险。系统进化树分析显示，FCV AH1与国内疫苗株Vaccine-FCV-D90357处于同一分支（图5），其他分离的8株华东地区分离株均与国内疫苗株亲缘关系较远。这也进一步解释了为何国内使用疫苗对猫的免疫效果不佳。

FCV isolated strains in East China

图5 华东地区分离株与国内疫苗株VP1基因基因遗传进化树

Fig.5 Phylogenetic tree of VP1 gene of 9 isolated strains in East China and the domestic vaccine strains in China

综上所述，本研究首次发现华东地区FCV不断发生变异，导致传统疫苗不能达到很好的免疫保护。分析了FCV在中国华东地区的流行状况及其遗传变异和演化方向，进一步丰富了我中国FCV的流行病学资料，为FCV疫苗研究提供了参考 。

六、参考文献

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