Cell Stem Cell | 杜鹏课题组利用全能性干细胞实现了小鼠早期胚胎发育过程的精准重建

早期胚胎发育是生命科学领域的核心研究方向之一。胚胎从受精卵开始发育，经过基因组激活（zygotic genome activation,ZGA） 、快速细胞分裂和谱系分化，最终形成囊胚，为胚胎着床及后续发育奠定基础。在这一过程中，囊胚内三谱系的形成——内细胞团 （inner cell mass, ICM） 、原始内胚层 （primitive endoderm, PrE） 和滋养外胚层 （trophectoderm, TE） ——标志着胚胎命运决定的关键转折点。然而，受限于胚胎样本的稀缺性和实验条件的限制，如何构建精准模拟早期胚胎发育的体外系统，仍是该领域亟待解决的科学难题。

2021年，北京大学杜鹏教授课题组通过抑制剪接体，首次捕获并稳定培养了小鼠全能性干细胞 （mouse totipotent blastomere-like cells, mTBLCs）（详见BioArt报道：） 。与经典的多能性干细胞不同，mTBLCs能够重现全能性卵裂球的特征，为构建从单细胞开始的分化和囊胚形成模型提供了理想的“种子细胞”。随后，在2024年，研究团队利用相同的策略成功获得了人的全能性干细胞 （详见BioArt报道：） ，为进一步探索全能性及其在胚胎发育研究中的应用提供了重要工具。

基于mTBLCs的这一特性，2025年1月17日，杜鹏课题组在Cell Stem Cell杂志在线发表了题为Mouse totipotent blastomere-like cells model embryogenesis from zygotic genome activation to post implantation的研究论文。在这项研究中，作者进一步优化了mTBLCs培养条件，并开发了mTBLCs自发分化和单细胞起始的类囊胚形成系统，mTBLCs-类囊胚具有EPI、PrE和TE谱系，并能进一步形成着床后阶段的卵圆柱胚样结构，重现了从ZGA至囊胚形成的完整发育过程。这一突破为研究全能性、细胞命运决定以及早期胚胎形态发生提供了新的技术平台，也为早期发育的基础与转化研究开辟了新的可能性。

图1. 通过mTBLCs模拟小鼠早期胚胎发育的关键事件的模式图

在本研究工作中，作者主要有以下发现：

1:该研究通过优化培养基 （2MYCP） ，显著提高了mTBLCs的增殖速度和长期自我更新能力，主要通过加入2-DG、Minocycline、Y-27632、CHIR-99021和PlaB等因子。在此过程中，PlaB发挥了关键作用，通过抑制剪接驱动了从多能性向全能性的转变，而Oct4基因的去除并未影响mTBLCs在2MYCP培养基中的自我更新能力，表明Oct4不是维持细胞全能性的必要条件。2MYCP培养基中，Wnt信号通路在mTBLCs中被激活，且Wnt信号通路与细胞周期、增殖通路的激活与mTBLCs的快速自我更新能力密切相关。进一步的实验结果表明，抑制Wnt信号通路可显著抑制mTBLCs的增殖，证明Wnt信号对于2MYCP培养基中mTBLCs的快速扩增至关重要，但它并不参与维持mTBLCs的全能性。

2. mTBLCs具有独特的表观基因组特征，这些特征有助于其全能性维持和快速自我更新。通过ATAC-seq和CUT&Tag分析，发现mTBLCs的启动子区域 （TSS） H3K27me3和H3K9me3整体水平下降，而H3K4me3、H3K27ac和RNA Pol II标记整体水平未发生显著变化，其表观特征与早期胚胎的初期胚胎细胞 （如2细胞阶段） 相似。此外，mTBLCs具有比PSCs更多的宽的H3K4me3域 （broad domain） ，以及更少的二价修饰基因 （bivalent gene） ，且MERVL转座子在mTBLCs中具有显著的H3K4me3标记。Wnt信号通路的激活进一步增强了与细胞周期和增殖相关基因的H3K4me3富集，从而促进了mTBLCs的快速增殖。

3.本研究进一步评估了mTBLCs在体内外的分化潜力。在嵌合体实验中，通过单细胞数据，捕获到了EGFP标记的mTBLCs生成的13种细胞，其中包括7个胚外谱系和6个胚内谱系，证明了其在嵌合小鼠中的双向发育潜能。此外，mTBLCs通过类胚体 （EBs） 和畸胎瘤实验也都展示出了胚内外双向分化潜能，产生了包括神经、心脏和肾脏等三胚层来源的细胞，也激活了包括经典滋养层标志基因，展示其能够生成胚外滋养层样谱系。总体而言，mTBLCs具有强大的双向发育潜力，能够分化为各种胚内外谱系，成为评估全能干细胞发育潜力的重要工具。

4.本研究利用mTBLCs建立了一个模拟胚胎着床前发育的体外分化模型，以克服现有体外分化系统的挑战。在基础分化培养基中培养mTBLCs约3-4天后，细胞形态发生显著变化，形成了胚胎干细胞 （ESC） 、胚外内胚层干细胞 （XEN） 和滋养层干细胞 （TSC） 样的克隆。RNA-seq分析显示，mTBLCs在分化过程中激活了不同发育阶段的基因，经历了从早期初级基因组激活 （minor ZGA） 到主要基因激活 （major ZGA） 的转变。免疫组化验证了mTBLCs能够分化为上胚层 （EPI） 、胚外滋养层 （TE） 和原始内胚层 （PrE） 等谱系。单细胞RNA测序揭示，mTBLCs在分化过程中产生了涵盖2细胞、4细胞、8细胞及囊胚阶段的多种细胞类型，拟时间分析显示mTBLCs经历了两次命运决定，首次产生TE样细胞和ICM/EPI样细胞，随后ICM/EPI样细胞分化产生了PrE样细胞。

研究进一步发现，在自发分化过程中，mTBLCs 还产生了Zscan4+ 和 Zscan4- 两类基因组激活样细胞 （ZLCs） 。拟时间分析表明，只有Zscan4- ZLCs 能够成功分化为 EPI、PrE 和 TE 三大谱系。因此，本研究提出，主要的 ZGA调控网络可能至少可以分为由 Zscan4 表达标记的两个独立部分。同时，Zscan4 的表达可能并不是进一步干细胞命运决定所必需的。这一观察结果也与人类 TBLC 的自发分化过程一致，在这一过程中，经典的 ZGA 标志基因 （如 ZSCAN4/5A、DUXA/B 和 TPRX1 等） 完全没有被诱导表达 （详见BioArt报道：） 。这些发现不仅进一步证实了 mTBLCs 的内在全能性，也为探索哺乳动物胚胎发育过程中的共性机制提供了新视角。

5. 此外，本研究发现，在没有任何外源性信号干预的情况下，单个mTBLC能够经历扩增、极化和压实过程，最终高效率的形成结构完整的类囊胚 （blastoid） 。这一类囊胚结构不仅包含内细胞团、原始内胚层和滋养外胚层等胚胎样细胞，且未见异常中间状态的细胞，mTBLC来源的囊胚在转录组上与体内囊胚更为接近，三个谱系的特定标志物富集。并且类囊胚可以在体外继续培养，发育成类似卵圆柱的后植入阶段结构。也可以将类囊胚移植到假孕小鼠中，其成功植入并形成卵圆柱样着床后胚胎结构。

综上，本研究首次建立了基于 mTBLC 的自发分化和胚胎样结构形成系统，成功模拟了胚胎早期发育的多个关键环节。尤其是在细胞命运决定和全能性研究领域，这一系统为理解早期胚胎发育中的细胞命运转变提供了新的视角。此外，该研究还为胚胎发育模型的应用开辟了新的可能性，未来基于这一系统，科学家们有望深入研究胚胎发育异常的分子机制，探索病理过程，甚至为解决不孕不育等生育医学问题提供全新解决方案。

杜鹏为该论文的通讯作者。北京大学生命科学学院博士后彭冰、北京大学前沿交叉学科研究院博士研究生王清仪、生命科学学院博士研究生张飞翔为本文的并列第一作者。北京大学生命科学学院博士后申辉参与了部分工作。

https://www.cell.com/cell-stem-cell/fulltext/S1934-5909(24)00446-6

制版人：十一

参考文献

1. Shen, H., Yang, M., Li, S., Zhang, J., Peng, B., Wang, C., Chang, Z., Ong, J., and Du, P. (2021). Mouse totipotent stem cells captured and maintained through spliceosomal repression.Cellhttps://doi.org/10.1016/j.cell.2021.04.020.

2. Li, S., Yang, M., Shen, H., Ding, L., Lyu, X., Lin, K., Ong, J., and Du, P. (2024). Capturing totipotency in human cells through spliceosomal repression.Cell187, 3284-3302.e23. https://doi.org/10.1016/j.cell.2024.05.010.

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