上海
2025年1月16日，中国医学科学院系统医学研究院/苏州系统医学研究所（以下简称“系统所”）叶子璐研究员与丹麦哥本哈根大学的Jesper Olsen课题组在Nature Methods杂志上发表了“Enhanced sensitivity and scalability with a Chip-Tip workflow enables deep single-cell proteomics”的论文。研究报道了一种高灵敏度的单细胞蛋白质组学技术Chip-Tip，可在单个HeLa细胞中鉴定到超过5000种蛋白质，并且无需任何富集策略可以在单细胞水平上有效地鉴定蛋白质翻译后修饰。该技术应用于5-氟尿嘧啶刺激下的肿瘤细胞和诱导多能干细胞分化过程中的单细胞蛋白质组分析，鉴定并精准定量到相应的蛋白质标志物，表明Chip-Tip技术具有卓越的灵敏度，可用于识别细胞特异性标志物和潜在治疗靶点等方向。
此前的单细胞蛋白质组学技术在每个细胞中通常只能鉴定1000-2000个蛋白质，组学覆盖深度的不足限制了其在研究细胞异质性等方面的应用，迫切需要开发更高灵敏度和覆盖深度的新型单细胞蛋白质组学分析方法。
此项研究中，作者创新性地开发了ProteoCHIP EVO 96芯片，将单个细胞分选至ProteoCHIP EVO 96芯片中，酶解完成后将ProteoCHIP EVO 96芯片中的样品直接转移到Evotip柱上，利用液相色谱结合前期该研发团队开发的nDIA方法采集数据。同时系统优化了nDIA方法的不同分离窗口和最大离子注入时间，结果表明4-Th DIA分离窗口和6ms的最大离子注入时间可实现较高的蛋白质组覆盖度，鉴定到5204个蛋白，在单个细胞中最多可鉴定到6000多个蛋白。高灵敏度的Chip-Tip技术鉴定到的蛋白定位所有亚细胞，鉴定到超过200多个膜蛋白。
作者通过Spectronaut和DIA-NN两种软件分析载体蛋白质组对单细胞蛋白质组鉴定的影响，发现载体蛋白质组可提高低丰度蛋白的鉴定效率，且两种软件的单细胞蛋白鉴定结果具有较高重现性。此外，利用entrapment数据库验证了数据的可信度，结果显示Spectronaut和DIA-NN均具有较高的鉴定可靠性。此外，研究者还开发了新型高通量的Whisper Zoom方法。对比了40 samples-per-day （SPD） 、80SPD和120SPD的鉴定结果，结果表明即使利用80SPD和120SPD方法也可以鉴定到超过4500个蛋白，并且空白样品中几乎没有鉴定到蛋白，说明此实验流程的低污染率。另外，在省略掉脱盐步骤的情况下，作者还进一步开发了利用Vanquish Neo液相结合FAIMS Pro Duo模块与Orbitrap Astral质谱分析96孔板的单细胞样品的方法，在单个HeLa细胞可鉴定到超过6500个蛋白，是目前国际上鉴定深度最高的单细胞蛋白质组数据集。鉴于当前Chip-Tip技术的鉴定深度，不需要任何的样品前处理，可实现在单细胞水平上鉴定蛋白质翻译后修饰，结果表明鉴定到高可信度的120个丝氨酸和苏氨酸磷酸化位点以及13个酪氨酸磷酸化位点，同时在单细胞中鉴定到168个蛋白激酶，包括所有主要的激酶家族。对于蛋白质糖基化修饰，鉴定到HexNAc、NeuAc和Hex-HexNAc等氧鎓离子。然而受限于数据库检索，在单细胞水平上精确鉴定修饰的肽段仍具有挑战性。
此外，将该方法用于5-氟尿嘧啶药物刺激后肿瘤细胞的单细胞蛋白质组分析，鉴定到超过2500个蛋白，并且鉴定到与5-氟尿嘧啶耐药性密切相关的标志物TYMP；将此方法用于分析诱导多功能干细胞分化过程中单细胞蛋白质组变化，鉴定到4700个蛋白且在较大的胚胎细胞中鉴定到6200个蛋白，同时也鉴定到多个细胞的特异性标志物，表明Chip-Tip技术具有高的鉴定深度与定量准确度。
综上所述，本研究代表了单细胞蛋白质组学领域的一次重大飞跃，将单细胞蛋白质鉴定的灵敏度从2000个显著提升至5000-6000个蛋白。该技术的强大性能使得能够深入解析单个细胞的分子复杂性，提供前所未有的组学覆盖深度。同时，这一方法无需任何富集策略即可高效分析单细胞中的蛋白质翻译后修饰，大幅简化了相关研究流程。这一技术突破为深入探索翻译后修饰的多样性和单细胞层面的调控机制提供了更加精简、高效的工具，为基础生物学和生物医学研究带来了新的可能性。
系统所叶子璐研究员为第一作者兼共同通讯作者，丹麦哥本哈根大学的Jesper Olsen为通讯作者。
https://www.nature.com/articles/s41592-024-02558-2
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