南京工业大学章文明/信丰学利用毕赤酵母实现虾青素生物合成

虾青素是一类具有较强抗氧化能力的类胡萝卜素，在保健、医药、化妆品、食品添加剂和水产养殖等领域有着广泛的应用。随着对天然产物需求的增加，虾青素的微生物生产已成为一个新的热点。

近日，南京工业大学的章文明教授、信丰学教授在 Journal of Agricultural and Food Chemistry 上发表了题为“Microbial astaxanthin synthesis by Komagataella phaffii through the metabolic and fermentation engineering”的研究论文，博士生王靖楠为论文的第一作者。该研究通过代谢工程改造巴斯德毕赤酵母成功实现了左旋虾青素的异源合成。

研究团队首先探究了虾青素合成关键酶 β-胡萝卜素酮醇酶和 β-胡萝卜素羟化酶的酶学性质，通过自组装和酶融合的方式提高关键酶活性，增强 β-胡萝卜素的转化效率。随后，通过辅因子工程和发酵工程优化，在摇瓶发酵中虾青素的产量达到 178.99 mg/L，5 L 生物反应器中产量达到 716.13 mg/L，为巴斯德毕赤酵母合成虾青素的最高产量，为新型抗氧化饲用蛋白的生产提供了技术支撑。

虾青素全称为 3，3'-二羟基-β 胡萝卜素-4，4'-酮，其具有比维生素 E 等更强的抗氧化活性（500 倍以上），可有效抑制细胞的氧化损伤和癌变，同时还具有抗高血压、预防心血管疾病、增强免疫等诸多功效，已广泛用于动物饲料、保健食品、化妆品和医疗制剂等领域。

欧盟已批准虾青素用作膳食补充剂，美国食品和药物管理局（FDA）也已批准将虾青素用作动物和鱼类饲料的食物着色剂，中国也允许在食品和饲料添加剂中使用虾青素。随着人们对天然产品需求的增加，预计到 2027 年，虾青素的市场规模将达到 34 亿美元。目前，虾青素的生产方法包括天然提取、化学合成和微生物发酵。然而，天然提取产量低、成本高，化学合成过程复杂、成本高且会产生有毒副产物。因此，微生物发酵因其环保和高效的特点而受到越来越多的关注。

首先，研究人员将来源于来源于雨生红球藻的虾青素合成途径整合至巴斯德毕赤酵母的基因组中，能够利用葡萄糖从头合成左旋虾青素（图 1）。为了解决虾青素合成菌株存在菌株退化的问题，研究人员将合成途径的各个基因替换了不同的启动子，获得了能稳定生产虾青素的工程菌株（图 2）。

随后，对虾青素合成途径关键酶 β-胡萝卜素酮醇酶（CrtW）和 β-胡萝卜素羟化酶（CrtZ）进行酶学性质探究，利用激光扫描共聚焦显微镜（CLSM）验证了这两个蛋白属于膜蛋白，并通过 qRT-PCR 探究了其对虾青素合成路径其他酶的影响（图 3）

基于此，对 CrtW 和 CrtZ 进行了自组装和酶融合，以减少中间代谢物的传输距离，增加酶的活性。此外，虾青素的合成过程需要 NADPH 的参与，研究人员将来源于酿酒酵母的 NADPH 再生途径引入巴斯德毕赤酵母中，构建辅因子工程。研究表明，通过辅因子策略，胞内的 NADPH 含量增加了两倍，虾青素合成途径中关键基因的转录水平明显提高。通过优化培养条件，包括：温度、碳源种类、碳源浓度、氮源种类，进一步提升虾青素的产量。以及外源添加金属离子、BHT 和吐温-80，将虾青素的产量提高至 178.99 mg/L。

最后，在 5 L 生物反应器中进行连续补料发酵，工程菌以葡萄糖为唯一碳源能产生 716.13 mg/L 虾青素，为巴斯德毕赤酵母生产虾青素的最高水平（图 4）。同时，也首次实现了以甲醇为唯一碳源合成虾青素。

1. https://pubs.acs.org/doi/full/10.1021/acs.jafc.4c10113

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