New Phytologist | 福建农林大学林学中心顾连峰课题组在开发BaMV载体递送的竹子基因编辑体系上取得进展

农杆菌介导的CRISPR/ Cas9核糖核蛋白复合物传递 (Woo et al., 2015, Toda et al., 2019, Ye et al., 2020) 是向植物递送CRISPR/Cas的常用方法，借助植物组织培养人们分别在毛竹 (Huang et al., 2022) 和麻竹 (Ye et al., 2020) 上建立了基因编辑体系并获得了稳定遗传的突变体材料, 为探究基因型到表型的关联提供了极大的便利。然而大多数林木的愈伤组织诱导和再生效率低，影响了基因组编辑在探究林木功能基因上的大规模应用。利用病毒RNA不整合到基因组的特点 (Ma et al., 2020, Chen et al., 2022) ，为人们实现无外源DNA整合的基因组编辑提供了一种方便、高效和成本效益高的方法。由于病毒载体的稳定性与插入的外源基因的大小呈负相关，将基于病毒的sgRNA载体传递给稳定过表达Cas9植株是最常用的策略 (Ali et al., 2015, Jiang et al., 2019, Li et al., 2021)。然而，这种方法对于长开花周期的竹子来说很难通过杂交的方式产生无外源Cas9的非转基因编辑材料。竹花叶病毒（BaMV）具有典型的柔性丝状病毒粒子结构，具有正义单链RNA基因组 (Hsu et al., 2018) 。前期课题组研究已经表明BaMV介导的表达系统可以有效地驱动外源大片段功能基因的表达 (Jin et al., 2023)。如能开发BaMV介导的非转基因竹子基因编辑体系将为探索竹子基因功能提供极大便利。

近日，福建农林大学林学中心顾连峰教授课题组在New Phytologist发表了题为Bamboo mosaic virus-mediated transgene-free genome editing in bamboo的研究论文（https://doi.org/10.1111/nph.20386）。该研究首先构建了能够同时递送SpCas9和sgRNA的病毒载体pBaMV-Cas9，初步建立了一种基于BaMV的CRISPR/Cas非转基因的竹子基因编辑递送系统。鉴于BaMV在散生竹和从生竹中均可以实现侵染, 因此上述系统有利于推动竹子基因编辑技术的基础研究和应用。

本文设计了 pBaMV-Cas9 载体，将 SpCas9 和 sgRNA 整合在 BaMV 的 TGBps 和 CP 之间（图 1）。异源 RNA 的表达由 CP 启动子控制。为了进一步增强 BaMV 的感染性并提高 Cas9 的表达水平，引入P19并通过 2A 肽将其与 SpCas9 相连。随后为了评估基于 BaMV 的递送系统在 N. benthamiana 内源位点定向突变中的可行性，选择了八氢番茄红素合酶（PDS）基因进行编辑。发现利用该载体在野生型本氏烟草系统叶片中实现NbPDS基因靶向编辑，Hi-TOM检测对应的编辑效率约为41.3%（图1）。Sanger测序也进一步验证了基因编辑位点的有效性 (图2)。

图1. BaMV介导的CRISPR/Cas9基因组编辑递送系统

为了评估利用 BaMV 介导的 CRISPR/Cas9 系统进行多重基因编辑的可行性，本文通过在sgRNA的3'端附加tRNAGly序列形成sgRNA1-tRNAGly-sgRNA2-tRNAGly（g1tg2t）结构，构建了能够分别靶向PDS 基因两个不同位点（gNbPDS 和 gNbPDS-2），以及同时靶向PDS 基因和 RNA 依赖的 RNA 聚合酶 6（RDR6）基因（gNbPDS 和 gNbRDR6）的载体pBaMV-g1tg2t-Cas9 (图1, 图2)。结果显示pBaMV-g1tg2t-Cas9能够同时在NbPDS两个不同位点实现基因编辑并产生长片段缺失。另外pBaMV-g1tg2t-Cas9也能够同时在NbPDS和NbRDR6实现基因编辑(图2)。但上述多个sgRNA的串联载体在一定程度上降低了编辑效率, 因此后续需要进一步优化多重突变载体系统, 以便保持较高的编辑效果。

图2. 多重基因编辑突变类型以及突变频率检测

为了进一步验证基于 BaMV 的 CRISPR/Cas9 系统在麻竹和毛竹中的基因组编辑效率，分别设计sgRNA分别靶向麻竹 DlmRDR6 和 毛竹PheRDR6 基因位点。利用 T7 核酸内切酶 I（T7EI）进行消化分析，结果表明目标基因编辑成功。在麻竹中, 叶片的突变频率为 9% 至 19%，茎杆中的突变频率为 6% 至 16%。类似地，在毛竹中，叶片的突变频率为 5% 至 16%，茎杆中的突变频率为 4% 至 16%。为了验证 T7EI 的结果，对 DlmRDR6 和 PheRDR6 靶点附近的序列进行检查，发现了多种插入和缺失突变（Indels），进一步证实了基因编辑的成功（图 3）。

图3. BaMV介导的麻竹和毛竹RDR6基因编辑

鉴于type II-A SpCas9核酸酶序列长度较大, 一定程度上影响了BaMV病毒载体的递送效率, 因此有必要测试紧凑型 Cas蛋白变体来提高病毒载体的递送效率。最近的研究表明type V-F AsCas12f1只有几百个氨基酸，特别是变体AsCas12f1-YHAM和AsCas12f1-HKRA在水稻中表现出更高的编辑效率(Ye et al., 2024)。于是在本研究中构建了pBaMV-HKRA和pBaMV-YHAM载体靶向编辑NbPDS，以测试BaMV介导的AsCas12f1在烟草中的编辑效率（图3, 图4）。结果显示pBaMV-HKRA载体介导的编辑效率约为26.27%，pBaMV-YHAM载体介导的编辑效率仅为1.72%。Sanger测序也证实，pBaMV-HKRA载体能够诱导靶基因的大片段缺失，这表明使用AsCas12f1-HKRA进行靶向DNA缺失的潜力很大。特别是鉴于竹子和水稻同为禾本科植物, 在竹子中优化BaMV驱动的紧凑型Cas蛋白变体来提高编辑效率具有较大的应用前景。

图4. 麻竹和毛竹中基因编辑效率检测

综上所述，该研究利用BaMV介导的CRISPR/Cas9系统，成功实现了对麻竹和毛竹无外源DNA整合的基因组编辑，证明了BaMV介导的CRISPR/Cas9在竹子研究中的应用潜力。尽管目前BaMV介导的CRISPR/Cas9系统在麻竹和毛竹基因组编辑效率仍然有待进一步提高，但该研究拓宽了基于正链RNA病毒的竹子基因编辑工具库，并推进了竹花叶病毒介导的基因编辑技术应用。也初步探索了紧凑型Cas蛋白病毒递送系统的可能性。BaMV可以对散生竹和丛生竹进行侵染，因此在竹子遗传改良和以竹代塑等方面具有应用前景。

福建农林大学林学院博士生吴林和林学中心杨珺、顾煜莹为论文共同第一作者，林学院王千一、张泽宇和林学中心郭弘珏、赵良真、张航晓也参与了本项目, 林学中心顾连峰教授为论文通讯作者。特别感谢南京农大谭俊杰教授分享AsCas12f载体, 为探究紧凑型Cas蛋白在竹子上的基因编辑提供了便利。该研究得到十四五国家重点研发项目、基金委面上项目和福建农林大学林学院高峰学科的支持。

参考文献

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全文链接：

https://nph.onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/nph.20386