Mol Cell | 复制依赖性双链断裂的修复在前导链和滞后链之间存在差异

撰文 | 染色体

细胞每天会发生大量单链断裂（SSBs） ，这些损伤可能由氧化应激或DNA代谢活动引起，并在复制过程中通过复制叉崩溃转化为单端双链断裂（seDSBs）【1】。seDSBs通常通过同源重组 （HR） 修复【2】，需要完整的姐妹染色单体作为模板，但具体机制尚未完全阐明。

近日，来自哥伦比亚大学欧文医学中心 （CUIMC） 的Lorraine S. Symington团队在Molecular Cell期刊发表题为Repair of replication-dependent double-strand breaks differs between the leading and lagging strands（复制依赖性双链断裂的修复在前导链和滞后链之间存在差异） 的文章。研究人员利用Cas9缺口酶（nCas9）系统在酿酒酵母中揭示了复制相关双链断裂（DSB）的修复机制。他们发现Cas9D10A诱导的缺口在S期形成DSB并依赖HR修复。复制偶联核小体组装（RCNA）通路在修复前导链断裂中起关键作用，而滞后链上则对缺口表现出较高的耐受性。

DNA修复的关键在于断裂末端的切除与单链DNA （ssDNA） 生成【3】。传统研究方法通常是利用喜树碱或特定核酸酶切割复制依赖性DSB，它们虽然有效，但缺乏位点和链的精确特异性。近年来，Cas9缺口酶 （nCas9） 通过向导RNA （gRNA） 设计，能够精确诱导位点特异性和链特异性的SSBs。研究发现，nCas9在前导链上引发的缺口主要转化为seDSBs，而在滞后链上产生双端双链断裂 （deDSBs） ，揭示了两种链在复制相关断裂修复中存在差异【4】。

复制依赖性DNA损伤的形成与链特异性修复机制

首先，研究人员创新性地采用nCas9在出芽酵母中精确引入单链缺口，模拟复制依赖性DNA损伤。这些缺口被设计为发生在前导链或滞后链模板上，分别代表两种不同的复制状态。结果显示，在S期，通过复制叉的动态行为，缺口转化为DSBs。具体而言，前导链的缺口倾向于生成seDSBs，而滞后链的缺口则更易形成deDSBs。这种链特异性差异反映了复制叉的几何特性和动态行为对DNA损伤形成的关键影响。进一步分析表明，复制依赖性DSBs的修复主要通过HR途径完成，而非经典非同源末端连接 （NHEJ） 。HR修复的关键步骤由Rad51介导，其在链入侵过程中发挥决定性作用。研究还发现修复依赖于RCNA通路及组蛋白修饰，尤其是H3K56乙酰化对促进同源染色单体配对和末端处理尤为重要。这表明染色质结构的动态调控直接影响DNA修复的效率与精确性。

修复因子、核酸酶活性与染色质调控对损伤修复的协同作用

接下来，研究人员通过全基因组筛选发现，多个与复制相关的核酸酶 （如Mre11、Dna2和Exo1） 在断裂修复中起关键作用。前导链的缺口主要依赖于Mre11复合物的切割活性，而滞后链的修复需要Dna2和Exo1的协同作用，显示出链特异性修复机制的差异。这种差异可能与前导链的连续合成模式和滞后链的不连续合成模式有关。滞后链的不连续性为断裂修复提供了更多的时间和空间，而前导链的快速复制动态则更易导致复制叉崩溃。此外，研究人员还发现染色质状态同样对修复效率产生显著影响。H3K56乙酰化在前导链断裂修复中发挥了关键作用，而滞后链修复则依赖于H4K16乙酰化和H2AX磷酸化等修饰。通过高分辨率显微镜和分子技术，研究人员追踪了修复因子的动态加载过程，发现前导链缺口更迅速转化为断裂，而滞后链的断裂生成则相对延迟。核酸酶活性的调控和染色质的开放状态共同影响了断裂末端的重塑和修复因子的招募。这些发现不仅揭示了复制依赖性DNA损伤的形成和修复机制，也突出了核小体动态调控、组蛋白修饰与核酸酶活性在维持基因组稳定性中的重要作用，为未来开发靶向基因组修复的新策略提供了重要启示。

综上所述，该研究结合多种技术手段，揭示了复制依赖性DSBs的生成和修复机制，阐明了前导链和滞后链修复的动态差异。研究强调核小体组装、组蛋白修饰和核酸酶活性在修复中的协调作用，为理解基因组稳定性提供新视角，并为靶向基因组修复技术奠定基础。这些发现对细胞生物学、癌症研究和基因编辑具有重要意义。

https://doi.org/10.1016/j.molcel.2024.10.032

制版人：十一

参考文献

[1] Tubbs, A., and Nussenzweig, A. (2017). Endogenous DNA Damage as a Source of Genomic Instability in Cancer.Cell168, 644-656. https://doi.org/10.1016/j.cell.2017.01.002.

[2] Mayle, R., Campbell, I.M., Beck, C.R., Yu, Y., Wilson, M., Shaw, C.A., Bjergbaek, L., Lupski, J.R., and Ira, G. (2015). DNA REPAIR. Mus81 and converging forks limit the mutagenicity of replication fork breakage.Science349, 742-747. https://doi.org/10.1126/science.aaa8391.

[3] Cejka, P., and Symington, L.S. (2021). DNA End Resection: Mechanism and Control.Annu. Rev. Genet.55, 285-307. https://doi.org/10.1146/an-nurev-genet-071719-020312.

[4] Pavani, R., Tripathi, V., Vrtis, K.B., Zong, D., Chari, R., Callen, E., Pankajam, A.V., Zhen, G., Matos-Rodrigues, G., Yang, J., et al. (2024). Structure and repair of replication-coupled DNA breaks.Science385, eado3867. https://doi.org/10.1126/science.ado3867.

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