中药单体1区 | 福建中医大揭示红景天苷促进自噬促进轴突出芽而激活对缺血性脑卒中的神经保护作用

今天分享一篇近期福建中医药大学药理学院等团队发表在《Phytomedicine》上的文章——《红景天苷通过促进自噬促进轴突出芽，从而激活对缺血性脑卒中的神经保护作用》。

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背景

缺血性脑卒中是一种常见的脑血管疾病，具有高发病率、高致残率、高死亡率和高复发率的特点。目前的药物治疗的局限性主要是单一的神经保护作用和狭窄的治疗时间窗，导致治疗效果不理想。自噬的激活可以促进神经再生。本研究的目的是阐明红景天苷是否可以通过自噬促进轴突出芽从而保护神经元。在体内，采用脑缺血再灌注损伤( MCAO / IR )模型，在体外，采用Oxygen -氧糖剥夺/复氧复糖( OGD / R )诱导的原代神经元细胞模型来评估红景天苷的神经保护作用。利用BDA神经示踪剂、免疫荧光和蛋白免疫印迹( Western blot，WB )确定其对轴突出芽和相关蛋白( MAP2、GAP43和PSD - 95)水平的影响。应用蛋白质组学、透射电子显微镜( TEM )和WB鉴定对自噬相关蛋白( beclin1、LC3、p62、LAMP2)、自噬体和溶酶体的影响。通过自噬抑制剂3 - MA阻断，进一步证实了红景天苷通过诱导自噬促进轴突出芽的机制。红景天苷在体内降低MCAO / IR诱导的神经功能缺损和梗死体积，在体外保护OGD / R诱导的原代神经元细胞。无论是在体内还是体外，它都增加了轴突的数量和长度，并上调了轴突关键蛋白( MAP2、GAP43和PSD - 95)和介导自噬相关蛋白的表达。机制研究表明，红景天苷对自噬和轴突出芽的促进作用在3 - MA阻断后消失。本研究首次报道了红景天苷在缺血性脑卒中中的神经保护作用可以通过介导自噬相关蛋白( beclin1、LC3、p62、LAMP2)，从而诱导轴突出芽或成熟蛋白( MAP2、GAP43和PSD - 95)来执行。

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研究结果

红景天苷改善MCAO / IR大鼠的脑梗死和减轻神经功能损伤

TTC与存活组织中的脱氢酶相互作用，产生红色的甲臜，而线粒体功能降低的MCAO / IR大鼠缺血半球脑组织中的脱氢酶活性限制了显色反应，使梗死区域呈白色或苍白色。因此，可以通过TTC染色评估脑梗死的程度并量化梗死体积。Sham组大鼠显示均匀的红色染色，而MCAO / IR组大鼠显示明显的白色或苍白的梗死区域，特别是皮质区。

红景天苷( Salidroside，Sal )的化学结构见图1A，Sal和阳性对照依达拉奉( Edaravone，Eda )的实验时间轴和给药方式示意图见图1B。用红景天苷或阳性对照Eda处理7天，可剂量依赖性地减少梗死体积(图1C ~ D)。此外，在第7天使用Longa评分系统进行神经功能缺损评分。

与假手术组大鼠相比，MCAO / IR组大鼠Longa评分较高，提示造模成功；红景天苷治疗导致Longa评分明显下降(图1E )。总的来说，这些观察表明红景天苷可以有效地减轻MCAO / IR大鼠的脑梗死体积和神经功能缺损的严重程度。在本研究中，为了评价红景天苷在体外和体内改善脑梗死和减轻神经功能损伤的作用，作者研究了红景天苷的3个剂量，包括12.5 mg / kg，25 mg / kg，50 mg / kg。红景天苷在50 mg / kg剂量下表现出最佳的改善脑梗死和减轻神经功能损伤的作用。因此，单一剂量的红景天苷( 50 mg / kg )被用于研究改善神经功能的机制。

图1

红景天苷增加MCAO / IR大鼠缺血半球Nissl阳性细胞计数和轴突出芽

尼氏小体是神经元细胞特征性的胞质结构，是合成蛋白质、酶和神经递质的关键位点，是神经元细胞的标志。当发生脑炎、脑缺血、轴突反应等时，会导致尼氏小体溶解，甚至消失，导致其数量急剧减少。因此，可以采用Nissl染色观察红景天苷对MCAO / IR大鼠缺血半球Nissl阳性细胞数量的影响，以明确红景天苷是否具有神经保护作用。结果显示，Sham组大鼠脑组织可见丰富的尼氏小体，神经元形态正常。相反，在MCAO / IR大鼠的缺血半球脑组织中观察到细胞核皱缩，尼氏体明显减少。红景天苷治疗7天后，MCAO / IR大鼠的神经元形态和尼氏小体数量有明显的恢复。尼氏染色结果提示，红景天苷可促进MCAO / IR大鼠(图2A ~ B)脑组织缺血半球神经元形态和数量的恢复。

使用BDA神经示踪剂进一步定量评估轴突出芽长度和连通性。正常的、未受损的神经细胞不需要出芽或再生；因此，假手术组(图2C和D)大鼠大脑皮层组织中未见BDA阳性细胞。而MCAO / IR大鼠表现出缺血半球的轴突轻微增加，以保护免受损伤。此外，红景天苷显著增加轴突出芽长度和交叉点(图2E)。

NF200是神经丝( NF )的一个亚型，是在神经元细胞质中发现的中间丝。它们是直径约为10 nm，长度为几微米的蛋白质聚合物，与微管和微丝共同构成神经元细胞的细胞骨架。如图2F - G所示，与MCAO / IR组相比，sham组可以观察到更多的NF200阳性细胞，然而，红景天苷可以增加NF200阳性细胞的长度。

MAP2是一种微管相关蛋白，主要存在于成熟神经元中，与神经元的结构和功能密切相关，尤其是与神经元中轴突生长、突触发生和神经可塑性相关。生长相关蛋白43 ( GAP43 )是神经元释放的神经营养蛋白，促进轴突侧支形成，建立新的突触。突触后致密物- 95 ( postsynaptic density-95，PSD-95 )是一种位于中枢神经系统突触后膜上的蛋白质，与突触的形成和成熟密切相关。结果显示，红景天苷显著上调GAP43、PSD - 95和MAP2(图3A - I)的阳性细胞数和表达。

图2

图3

体内蛋白质组学分析表明红景天苷诱导多种溶酶体蛋白的改变

以P值< 0.05且差异倍数≥1.5为显著上调，差异倍数< 0.667为显著下调，作为筛选各组脑组织样本中DEPs的标准。与Sham组相比，MCAO / IR组大鼠有413种蛋白表达上调，75种蛋白表达下调；与MCAO / IR组相比，红景天苷处理后有22个蛋白表达上调，80个蛋白表达下调(图4A )。构建Venn图对比较组之间的DEPs交集进行可视化，揭示了红景天苷与缺血性脑卒中之间的DEPs交集中12个上调和63个下调蛋白(图4B )。此外，还创建了一个火山图用于视觉再现(图4C )。

对差异蛋白进行功能富集分析发现，在生物过程( Biological Process，BP )方面，所有对照组富集类别前5位分别为细胞过程、生物调节、刺激响应、代谢过程和多细胞生物过程。就CC ( Cellular Component )而言，富集的类别是细胞、细胞内和含蛋白质的复合物。关于MF (分子功能)，富集最多的2个类别是结合和催化活性(图4D - E)。亚细胞结构定位分析显示，与Sham组相比，MCAO组DEPs的主要亚细胞结构包括细胞外( 25.1 % )、细胞质( 24.69 % )和细胞核( 22.43 % )。与MCAO组相比，红景天苷治疗组DEPs的主要亚细胞结构包括细胞外( 36 % )，细胞质( 22 % )和细胞核( 19 % ) (图4F )。

此外，对DEPs进行KEGG通路富集分析。结果显示，MCAO / IR与Sham组比较，以及红景天苷与MCAO / IR组比较，涉及的前2个信号通路包括溶酶体和补体与凝血级联反应(图4G - H)。之前的研究已经证明，红景天苷通过减少补体和凝血级联反应的激活来保护神经元。基于自噬激活的神经保护作用及其在蛋白质组学KEGG分析中的首位通路地位，可以进一步采用PPI分析来研究红景天苷处理后参与溶酶体途径的DEPs。使用Cytoscape 3.9 . 2软件进行可视化。与MCAO / IR组相比，红景天苷处理组发现红景天苷上调溶酶体途径中的自噬相关蛋白，如Lamp1 / 2，Beclin - 1和Ctsc (图4I )。

图4

红景天苷激活自噬-溶酶体途径

对红景天苷诱导的差异蛋白进行蛋白质组学富集分析，发现这些蛋白主要富集在溶酶体途径。因此，作者利用TEM分析了红景天苷在不同阶段对自噬体形态变化的影响。结果表明，在MCAO / IR组中，缺血半球的自噬溶酶体(蓝色箭头)和溶酶体(红色箭头)的数量明显减少。红景天苷处理后，自噬溶酶体(图5A)数量显著增加，之后进一步分析了红景天苷对自噬流的影响。

自噬流过程涉及多种关键蛋白的协同作用。Beclin1是自噬中促进早期吞噬体形成的关键蛋白，LC3 (微管相关蛋白1A/1B轻链3)是自噬体形成和成熟的标志蛋白。溶酶体标记物LAMP2是位于溶酶体膜上的一种高度糖基化的跨膜蛋白，是自噬-溶酶体成熟过程中的关键调控因子，促进自噬体与溶酶体的融合，维持溶酶体的完整性膜，并保护其免受溶酶体蛋白酶的降解。结果发现，在MCAO / IR组中，LAMP2、beclin1和LC3的水平降低，但在红景天苷处理(图5 B ~ H)后，LAMP2、beclin1和LC3的表达显著上调。

P62（SQSTM1 )是一种选择性自噬接头蛋白，其LC3相互作用区域( LIR )可与自噬标志物LC3结合，促进p62及其相互作用蛋白的自噬降解，从而抑制自噬。结果发现，在MCAO / IR组中，p62的表达增加，但其表达被红景天苷(图5 I)显著下调。以上研究结果表明，红景天苷能够激活自噬流，促进溶酶体的形成。

图5

红景天苷通过自噬促进轴突出芽

之前的研究结果表明，红景天苷显著促进轴突出芽，并能激活自噬-溶酶体途径。然而，它是否通过自噬-溶酶体途径促进轴突出芽仍然未知。因此，向sham或MCAO / IR大鼠脑内注射自噬抑制剂3 - MA (图6A )，实验设计和给药时间线如图6B所示。简而言之，用于评估红景天苷对MCAO / IR疗效的动物，大鼠缺血2 h后再灌注，红景天苷腹腔注射的统一处理周期为1 h。对于抑制剂的注射，提前30 min进行干预，先给予抑制剂干预，再进行MCAO，2 h后再灌注，同样给予红景天苷1 h。结果显示，在MCAO / IR大鼠缺血组织中，Nissl小体阳性细胞数量减少，(图6C ~ D)。红景天苷处理上调了Nissl小体的数量并促进了轴突的出芽，增加了它们的长度(图6E和I)，以及它们的交叉数(图6G和J)。然而，当用3 - MA阻断自噬后，红景天苷上调尼氏小体和促进轴突出芽和延长的作用减弱。此外，红景天苷对促进轴突出芽关键蛋白GAP43、MAP2、PSD - 95的影响在自噬被3 - MA (图6O - Q)阻断后也被取消。这表明红景天苷的神经保护作用及其促进轴突出芽的作用是通过激活自噬途径实现的。

此外，检测了各组大鼠大脑缺血半球中自噬相关蛋白p62、beclin1和LC3以及溶酶体标志物LAMP2的表达。结果表明，MCAO / IR大鼠缺血组织中LAMP2的表达较Sham组显著降低，红景天苷治疗显著上调LAMP2。然而，当MCAO / IR大鼠给予3 - MA处理后，红景天苷对LAMP2的上调作用消失(图6K )。自噬相关蛋白p62、beclin1、LC3(图6L - N)也出现了类似的现象。以上结果表明，自噬抑制剂3 - MA成功抑制了自噬流中关键蛋白的表达，而红景天苷不能逆转3 - MA对自噬流的抑制作用。

图6

红景天苷通过自噬途径抑制缺血半球细胞凋亡

TUNEL染色分析显示，与假手术组相比，MCAO / IR大鼠缺血半球内的凋亡细胞显著增加。然而，红景天苷显著抑制了缺血半球细胞的凋亡。然而，用3 - MA (图7A - B)阻断后，红景天苷对细胞凋亡的抑制作用消失。红景天苷单独上调抗凋亡蛋白Bcl - 2的表达和活化型半胱天冬酶-3的表达，下调促凋亡蛋白Bax的表达，但经3 - MA处理后，红景天苷对两者的调节作用消失(图7C - E)。均表明红景天苷通过自噬途径抑制缺血半球细胞的凋亡。

图7

红景天苷抑制OGD / R诱导的原代神经元丢失

在阐明红景天苷对MCAO / IR大鼠的神经保护和促进轴突出芽的作用后，分离体外原代神经元细胞，用神经元标志蛋白MAP2进行免疫荧光染色，标记神经元的数量和神经生长的形态。结果发现红景天苷不仅增加了神经元数量和MAP2蛋白的荧光强度也显著增加了MAP2 (图8A - C)标记的神经生长长度。此外，红景天苷增加神经营养蛋白GAP43的表达，从而促进神经元分支形成建立新的突触，增加突触后致密蛋白PSD - 95的表达，从而促进突触形成和成熟(图8D - E)。在原代培养的神经元中也发现红景天苷可以剂量依赖性地调节自噬相关蛋白，如上调beclin1、LC3、抑制p62，以及溶酶体标志蛋白LAMP2 (图8F - I)。以上研究结果表明，红景天苷在体外具有保护原代神经元细胞免受损失和促进自噬的作用。

图8

红景天苷通过自噬抑制OGD / R诱导的原代神经元丢失

在建立红景天苷对原代神经元细胞的神经元生长作用后，用自噬抑制剂3 - MA处理细胞，证实红景天苷通过自噬途径促进原代神经元细胞的神经元生长。结果表明，红景天苷显著增强了溶酶体相关蛋白LAMP2的表达，但这种红景天苷对LAMP2的上调作用在3 - MA处理后消失(图9A )。同样，自噬相关蛋白beclin1和LC3的上调以及红景天苷对p62的抑制在3 - MA (图9B - D)处理后均消失。此外，红景天苷对体外(图9E - G)细胞中轴突形成或突触成熟标志物MAP2、GAP43和PSD - 95表达的促进作用在3 - MA处理后减弱或消失。这些发现表明，红景天苷通过自噬-溶酶体途径抑制原代神经元的丢失。图9H描述了红景天苷调节自噬从而保护神经元的机制。

图9

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文章的创新点及启示

01 多学科方法结合：本研究采用体内蛋白质组学与实验验证相结合的方法，系统地探讨了红景天苷对缺血性脑卒中的神经保护作用。体内蛋白质组学预测出红景天苷的潜在靶点和通路。涉及的前2个信号通路包括溶酶体和补体与凝血级联反应。之前的研究已经证明，红景天苷通过减少补体和凝血级联反应的激活来保护神经元，且红景天苷上调溶酶体途径中的自噬相关蛋白，如Lamp1 / 2，Beclin - 1和Ctsc 的表达。所以之后通过体内外实验验证，为红景天苷通过激活自噬而促进轴突出芽，从而产生神经保护作用提供证据。

02 明确作用机制：文章首次明确了自噬-溶酶体通路在红景天苷神经保护作用方面的重要性。

03全面的实验设计：文章不仅在动物模型中验证红景天苷的作用机制，还用原代细胞在体外实验中验证其机制。通过使用3-ma自噬抑制剂，进一步确认自噬-溶酶体通路在红景天苷神经保护作用中的重要性，确保研究结果的可靠性和科学性。

https://doi.org/10.1016/j.phymed.2024.156208 IF: 6.7 Q1 B1

转自公众号：天然产物化学生物学交叉创新团队，侵删~

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