Science重磅：细胞分辨率的全脑空间转录分析

【导读】RNA分析的最新进展，加深了科学界对生物组织细胞状态的了解。然而，在将RNA表达数据与各器官的空间背景相结合方面仍存在很大差距，这主要是由于在完整组织体积内检测RNA所面临的挑战。在这项研究中，团队开发了一种有效的组织清除方法，用于全脑空间三维（3D）RNA成像。

2024年11月21日，瑞典卡罗林斯卡医学院在期刊《Science》上发表了题为“Whole-brain spatialtranscriptional analysis at cellular resolution”的研究论文。TRISCO解决了几个关键问题，包括保持RNA的完整性、实现均匀的RNA标记和提高组织透明度。TRISCO有望成为单细胞、全脑三维成像的强大工具，可对整个大脑进行全面的转录空间分析。

https://www.science.org/doi/10.1126/science.adn9947

关于TRISCO

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要了解细胞的空间关系及其参与的回路，就必须在全脑范围内对分子进行三维（3D）可视化。目前科学界已发表了多种组织清理方案，用于成像体积，其中绝大多数方案侧重于评估蛋白质而非RNA转录物的分布。虽然有一些开创性的方案尝试将RNA成像与组织清理相结合，但应用于较大的组织，如整个哺乳动物大脑，仍然具有挑战性。

团队最近开发了原位免疫荧光标记清除样本（DIIFCO）诊断技术，该技术结合了原位HCR（isHCR）和有机溶剂清除技术，用于研究小鼠胚胎、脑切片和临床活组织切片中的RNA。鉴于对全脑空间转录分析的高需求，团队对成人全脑样本进行了DIIFCO评估，但得出的结论是，由于RNA的完整性差、标记不均匀和透明度弱等问题，这种方法不适合对完整大脑中的RNA进行可视化。

在这项研究中，团队提出了一种新技术--Tris缓冲液介导的清除器官中isHCR信号的保留（TRISCO），它可以在有机溶剂清除后，对具有均匀isHCR信号和高组织透明度的全脑进行空间RNA分析。TRISCO为实现单细胞分辨率的全脑三维成像提供了一种简单易行的方法，它能捕获全面的转录本阵列，从而揭示整个大脑的转录景观。

TRISCO可实现单细胞分辨率的全脑RNA成像

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团队使用共聚焦显微镜进行了定量分析，计数并比较了从三维TRISCO染色大脑切取的组织切片中Csf1r阳性细胞的数量，以及使用传统isHCR染色的组织切片中Csf1r阳性细胞的数量。这项分析表明，二维和三维方法在纹状体中检测到的Csf1r阳性细胞的百分比几乎相同，这表明TRISCO可以覆盖整个区域。此外，团队还分析了与多巴胺、血清素和乙酰胆碱等大脑高级功能神经递质有关的RNA转录物的表达：Th、Slc18a2、Slc6a3、Tph2、Ddc、Maoa、ChAT、Slc13a3和Ache。TRISCO揭示了大脑深部结构的特定基因表达模式，如基底节和脑干。体积渲染和放大进一步突显了PvalbmRNA和ThmRNA错综复杂的转录模式，以单细胞分辨率解析了整个小鼠大脑的转录模式。

各种RNA转录本的全脑TRISCO染色。

评估跨哺乳动物器官和神经元活动的TRISCO成像

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为了评估TRISCO检测整个大脑功能性神经元活动的能力，团队评估了接受药理学治疗的小鼠体内早期基因c-Fos的表达情况。团队观察到，与药物治疗小鼠相比，食欲和体重调节相关的不同区域的c-FosmRNA表达增强。为了验证TRISCO的结果，团队使用免疫标记的溶剂清除器官三维成像技术（iDISCO），将c-FosmRNA表达与c-Fos蛋白免疫染色进行了比较。分析结果显示，孤束核和脐旁核的mRNA和蛋白计数相似。

总之，这些数据表明，TRISCO是一种强大的工具，可用于全面研究整个大脑中的细胞特征、非编码RNA表达和调控基因的转录。

利用c-Fos标志对大型啮齿动物大脑和神经元活动，进行全脑TRISCO分析。

总结

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1. TRISCO技术的优势：TRISCO技术通过低温孵育实现均匀染色，减少了图像处理中的归一化需要，并且可以设计和使用定制探针，覆盖广泛的RNA物种。

2. 简易性和多功能性：TRISCO技术易于使用，无需专业设备，可应用于各种实验室环境，并且有效于不同大小的大脑，如小鼠、大鼠和豚鼠。

3. 可扩展性和适用性：TRISCO技术不仅适用于脑部成像，还适用于脊髓、心脏、肾脏和肺部等多种组织，拓宽了其潜在应用领域。

4. 局限性与改进潜力：TRISCO技术存在一些局限性，如信噪比和渗透问题，但这些可以通过优化关键参数和样品制备方法来克服。

5. 多轮分析的潜力：预计通过优化组织清除和探针移除，TRISCO可以实现多轮分析，提高多重分析能力。

6. 自动化和实用性：通过加快程序和增强探针穿透力，TRISCO技术有望变得更加实用，实现高含量三维成像。

7. 三维转录数据的宝库：TRISCO技术的开发，标志着高性能成像技术的巨大进步，开启了尚未开发的庞大三维转录数据宝库。

8. 神经科学研究的关键缺口：TRISCO技术通过实现RNA转录本的体积可视化和分析，弥补了神经科学研究中的一个关键缺口，将神经转录本概况与空间坐标联系起来，探索大脑的动态复杂景观。

参考资料：

1.P. Ariel, A beginner’s guide to tissue clearing. Int. J. Biochem. Cell Biol. 84, 35–39 (2017).

2.H. R. Ueda, A. Ertürk, K. Chung, V. Gradinaru, A. Chédotal, P. Tomancak, P. J. Keller, Tissue clearing and its applications in neuroscience. Nat. Rev. Neurosci. 21, 61–79 (2020).

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