Nature｜染色质重塑驱动免疫细胞-成纤维细胞互作加重心衰

撰文｜风

构成机体的细胞可能随时面临多种压力，例如感染、炎症、缺氧、营养和代谢等。这些压力诱导的信号最终汇聚到细胞核导致基因表达改变甚至功能失调【1】。慢性炎症和组织纤维化是组织器官功能紊乱的共同特征【2】。在疾病器官中，压力诱导的基因表达谱改变驱动细胞功能失调和细胞间的病理性相互作用。尽管如此，从压力感知到纤维化启始的过程机制仍旧不清楚。

近日，美国旧金山市格莱斯顿研究所Deepak Srivastava研究团队在Nature杂志在线发表题为Chromatin remodelling drives immune cell-fibroblast communication in heart failure的研究论文。该研究揭示BRD4依赖的IL-1β介导的巨噬细胞-成纤维细胞互作在组织纤维化重塑中的重要作用，为心衰等慢性组织重塑性疾病提供治疗策略。

作者前期研究发现，在多种疾病中传递压力应激染色质信号的关键因子- （bromodomain and extra-terminal domain，BET） 蛋白的抑制剂可以在心衰中通过MEOX1调节成纤维细胞的激活【3,4】。为了识别心衰中细胞状态的动态改变和鉴定调控压力依赖转录的上游信号，作者在小鼠中使用主动脉弓缩窄 （transverse aortic constriction，TAC） 诱导心衰模型，并结合JQ-1 （BET抑制剂） 治疗。与既往研究一致【4-9】，JQ-1对心功能具有保护作用。scRNA-seq分析发现非心肌细胞包括成纤维细胞 （Dcn+） 、髓细胞 （Lyz2+） 、内皮细胞 （Fabp4+） 和周细胞（ Abcc9+） 。随后，作者将基因表达与心功能做关联性分析，将表达上调与心功能降低和下调表达与心功能改善定义为负相关，同步变化定义为正相关。与预期相符，成纤维细胞具有最高的相关性，髓细胞次之，表明这些细胞在心功能改变时的高转录可塑性。考虑到BET蛋白是转录激活因子，作者分析BET抑制引起髓细胞上调和下调基因，发现上调基因中与心功能呈负相关的有Il1β、Ccl8、Ccl12、Cx3cr1和Runx3。髓细胞亚群分类将细胞分为7群，Il1β和Cx3cr1共同高度富集在C1群，且JQ-1处理抑制这些基因的表达。作者前期研究揭示BRD4在心衰中的重要作用，因此构建单核-巨噬细胞特异性敲除BRD4的小鼠 （Cx3cr1creERT2;Brd4flox/flox） 并行TAC造模，发现BRD4敲除组小鼠具有更好的心功能和降低的纤维化。为了进一步揭示是心肌驻留巨噬细胞或浸润单核细胞来源巨噬细胞起作用，作者在Cx3cr1creERT2;Brd4flox/flox小鼠中使用10天他莫昔芬处理接6周无他莫昔芬处理以特异性敲除驻留巨噬细胞中BRD4，TAC造模后发现心肌功能并没有显著改善，表明BRD4促进心衰主要来源于外周单核细胞来源巨噬细胞。随后，作者在Cx3cr1creERT2;Brd4flox/flox小鼠经TAC造模小鼠分离CD45+细胞行scRNA-seq。分析结果显示单核巨噬细胞是主要的浸润群体，其中C4群在心衰中扩增，JQ-1治疗后降低。GO注释表明C4群与促炎通路相关，包括LPS反应、炎症反应调节和细胞因子产生。C4群富集基因包括MHC分子、Il1β和Ccr2等，表明BRD4驱动促炎相关转录活动。

紧接着，作者探究心衰时非细胞自发行为。为此，作者在Cx3cr1creERT2;Brd4flox/flox小鼠TAC造模小鼠对所有心肌细胞行snRNA-seq。分析发现成纤维细胞和髓细胞有类似的差异基因数量。由于成纤维细胞BRD4正常表达，提示成纤维细胞的基因表达改变是一种非细胞自发行为。聚类分析将成纤维细胞分为7群，其中C6群与成纤维细胞活化有关，其高表达Postn、Meox1、Comp、Cilp、Mfap4和Thbs4。随后，团队使用scATAC-seq分析在Cx3cr1+细胞BRD4敲除时心衰中细胞的染色质可即性。结果证实成纤维细胞Postn和Meox1等活化相关基因染色质可即性增强，表明成纤维细胞转录组和染色质组改变同步。与此同时，对BRD4敲除和对照组成纤维细胞差异可 即性区域的Motif分析表明这些区域富集的转录因子与心衰促纤维化反应有关，例如SMADs、MEOX1、RUNX1和REL等，表明Cx3cr1+细胞BRD4缺失促进成纤维细胞活化。

Cx3cr1+细胞BRD4缺失如何影响成纤维细胞呢？对BRD4敲除小鼠CD45+细胞的scATAC-seq分析，结果发现单核巨噬细胞对TAC造模以及BRD4敲除最敏感变化的区域附近的基因为Il1β、Mreg、Cdh26、Cdh23、Cd83、Ccrl2和Egr1。为了进一步揭示BRD4直接调节哪些元件，团队构建在BRD4的N端插入3×Flag的小鼠经TAC造模后分选Cx3cr1+细胞行CUT&RUN分析，结果发现相比于对照组，TAC组Cx3cr1+细胞最显著的BRD4结合区域为Il1β、Mreg、Cdh26和Cd83。基于上述结果，作者发现Il1β是Cx3cr1+细胞中对TAC造模以及BRD4敲除变化最敏感的基因，同时也是与心功能显著负相关的细胞因子。公共数据库分析RELA转录因子富集在Il1β基因座上。另外，CUT&RUN分析指出BRD4也可能结合在Il1β基因座位的1、2、5和6峰。体外CRISPR-Cas9介导敲除和荧光素酶报告实验证实5和6峰是BRD4的结合位点。随后，作者发现Cx3cr1+细胞分泌的IL-1β激活成纤维细胞。首先，成纤维细胞表达IL-1β受体Il1r1。其次，IL-1β在体外可以促进成纤维细胞αSMA和胶原产生，尤其在与TGF-β联合使用时最为明显。另外，在巨噬细胞和成纤维细胞共培养时，LPS刺激的巨噬细胞可以促进成纤维细胞胶原产生，这个过程却可以被IL-1β中和抗体抑制。IL-1β+TGF-β刺激的成纤维细胞RNA-seq分析差异基因发现促纤维化转录因子MEOX1高表达。siRNA介导MEOX1敲低显著抑制IL-1β+TGF-β诱导的成纤维细胞胶原产生。有趣得是，体外实验表明RELA和BRD4参与IL-1β诱导的MEOX1高表达。总之，这些数据表明IL-1β通过MEOX1促进纤维化。

最后，作者检测体内IL-1β阻断是否抑制纤维化并改善心功能。团队在WT小鼠构建TAC模型后给予IL-1β中和抗体或IgG对照。与预期一致，IL-1β中和抗体显著改善心功能并减少心脏纤维化。由于IL-1β中和抗体可以阻断多种细胞，作者构建Cx3cr1+细胞特异敲除IL-1β的小鼠 （Cx3cr1creERT2;Il1βflox/flox） 与对照小鼠行TAC造模，发现IL-1β敲除小鼠具有更好的心功能。对IL-1β中和抗体实验和Cx3cr1creERT2;Il1βflox/flox小鼠实验心脏的scRNA-seq分析均表明心脏成纤维细胞的促纤维化基因在IL-1β干预后显著降低，例如Postn和Meox1；GO注释分析表明细胞外基质重塑得到显著改善。这些结果均表明IL-1β信号在心衰时调控成纤维细胞活化的重要作用。

综上所述，这项研究通过单细胞组学、表观遗传学、基因敲除和基于CRISPR的增强子敲除等方法揭示压力扰动引起浸润巨噬细胞BRD4介导的染色质重塑促进IL-1β引起的成纤维细胞活化在心衰中的作用，一方面为慢性组织重塑性疾病提供治疗靶向手段，另一方面为组织器官压力扰动引起的细胞交流提供理解。

原文链接：https://doi.org/10.1038/s41586-024-08085-6

制版人：十一

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