脑声问答（107）期丨啮齿动物注意力相关行为评估范式总结

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五项选择序列反应时任务

（5-Choice Serial Reaction Time Task, 5CSRTT）

5CSRTT是一种用于评估啮齿动物（如大鼠和小鼠）的认知功能，特别是注意力、冲动控制和信息处理速度的行为测试。这个任务是基于视觉刺激的反应时间测试，可以用来评估动物的注意力集中、决策制定和认知灵活性。

方法：

动物在一个带有五个孔的盒子中，每个孔有一个灯。灯随机亮起，动物必须用鼻子触碰亮起的灯才能获得奖励。测试过程中可以调整灯亮的时间和间隔。通常使用五种不同的视觉刺激（例如，不同的光栅模式），动物必须学会区分这些刺激。动物需要学会在特定的刺激出现时舔触摸屏以获得奖励（例如，食物颗粒）。如果动物在非目标刺激出现时舔屏幕，通常会有惩罚（如时间罚分）。刺激会按照一定的时间间隔连续出现，动物需要对每个新出现的序列刺激做出反应。

记录动物的反应时间用来评估其处理信息的速度。任务设计用来评估动物的持续性注意力和冲动控制能力。例如，动物可能会因为过早反应（在刺激出现之前）或在刺激消失后反应而受到惩罚。

指标：

正确反应的次数、错误反应的次数、遗漏反应的次数、反应时间等。

Fig1 5项选连续反应时间任务的试验阶段和可能的结果

注意定势转移任务

（Attentional Set Shifting Task, ASST）

ASST是一种用于评估动物认知灵活性和执行功能的行为测试。它主要用于研究注意力的转换能力、抑制控制和工作记忆。ASST在人类心理学中也有广泛的应用，但在动物模型中，它通常用于评估前额叶皮层的功能，特别是与注意力和决策相关的功能。评估动物在面对新任务时的适应能力和灵活性。研究前额叶皮层在注意力转换和抑制控制中的作用。还可评估药物对认知功能的影响，特别是对注意力和执行功能的改善或损害。研究各种神经退行性疾病（如阿尔茨海默病、帕金森病）和精神疾病（如注意力缺陷多动障碍、抑郁症）对认知功能的影响。

Fig2视觉（条纹）和听觉（纯音）会同时呈现给小鼠。只有一个模态的刺激与获得水奖励相关。相关模态中的一个刺激（顶行）被指定为“去”信号，小鼠需要对它舔舐以获得水奖励，而对于“不去”刺激，则期望它们抑制舔舐

实验步骤：

通常使用一个带有多个操作孔的操作箱，每个孔中可以放置不同的刺激物。刺激物可以是不同颜色、形状或纹理的物体，用于引导动物的注意力。动物首先需要学会基本的任务，例如通过触摸特定的颜色或形状来获得奖励。

简单维度辨别：动物学会根据一个特定的维度（如颜色或形状）来选择正确的刺激物。例如，如果任务是基于颜色，动物需要学会选择红色而不是蓝色的物体。

复合维度辨别：引入第二个维度，动物需要同时考虑两个维度（如颜色和形状）来选择正确的刺激物。例如，动物需要学会选择红色圆形而不是蓝色方形。

反转学习：在复合维度辨别任务中，改变奖励规则，使原本正确的选择变为错误的选择，反之亦然。例如，如果之前红色圆形是正确的，现在改为蓝色方形是正确的。

维度转移：改变任务的维度，使动物需要从一个维度转移到另一个维度。例如，从基于颜色的选择任务转移到基于形状的选择任务。

逆转维度转移：在维度转移后，再次进行反转学习，使动物需要在新的维度上重新学习新的规则。

评估指标：

• 正确反应次数：在每个阶段中，动物正确选择的次数。

• 错误反应次数：在每个阶段中，动物错误选择的次数。

• 完成任务所需的时间：从开始到完成每个阶段所需的时间。

• 学习曲线：记录动物在各个阶段的学习表现，绘制学习曲线以评估其学习和适应能力。

注意事项：

使用的动物是4到6个月大的雄性C57Bl/6J小鼠，以获得最佳结果。小鼠被维持在一个反向光照周期中，以便在活跃（黑暗）阶段方便地进行测试。如果行为测试在与饲养房间不同的房间进行，小鼠在运输到测试房间后至少需要1小时适应。行为测试在红光条件下进行，以尽可能减少对小鼠正常活动的干扰，同时确保实验者有足够的光线来目测监控测试过程。

将陶瓷小碗（非多孔；深度1.5英寸，直径2.5英寸）填满挖掘介质（距底部约1英寸），并在碗内背面贴上切成半圆的滤纸。将轻微甜味的干早餐谷物（如蜂蜜坚果或糖衣谷物）破碎成约20毫克的小块，用于适应、训练和测试阶段。制作注意力定势转移任务（AST）室：为每只小鼠单独准备AST室，建议至少制作8个室。构建一个12英寸 x 8英寸 x 7英寸的AST室，墙壁和起始门由易于清洁的不透明白色亚克力制成，起始门采用滑动式可拆卸设计，将室分为等待区（5英寸 x 8英寸）和测试区（7英寸 x 8英寸）。包括一个透明的5英寸 x 7英寸可拆卸隔板，将测试区均匀分为两部分；在隔板底部切割三个直径1/4英寸的孔，间距1英寸，距隔板前端1英寸，以便嗅探。

动物模型构建与行为评估交流群

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1. 实验前准备：

在AST之前，将小鼠单独饲养，并至少调整一周以适应反向光照周期。

适应、训练和测试每只小鼠时，每个室分配给一只小鼠，并在测试最后一天后用70%乙醇清洁，以减少测试期间的压力，使室闻起来像“家笼”或“自己”。

2. 测试盆的气味处理：

测试前2天，对测试盆进行气味处理，以使气味消散；小鼠不会在有强烈气味的盆中挖掘。使用带有25G针头的注射器，向滤纸上滴加约0.1毫升的精油。

3. 处理（第18天）

从首次食物限制前8天开始处理小鼠，以减少测试期间处理带来的压力。每天称量并记录体重。每天处理每只小鼠23分钟。

4. 食物限制（第9-12天）

在适应开始前4天，将小鼠置于限制饮食中，以维持其体重在自由进食体重的80-85%。每天每只小鼠给予1克食物。如果体重低于规定范围，每天给予2克食物，直至恢复到适当范围。在每个家笼的前面放置2个陶瓷小碗，以便小鼠适应测试盆。这些位置与训练小鼠挖掘食物奖励的位置相同。每天在每个陶瓷小碗中加入2克食物和1块食物奖励（每碗半块谷物）。

如果行为测试在与饲养房间不同的房间进行，从食物限制第一天开始，每天将小鼠运输到测试房间至少1小时，然后再送回饲养房间，以适应测试房间。

在食物限制的最后一天，即适应开始前，更换家笼的垫料。测试完成后不再更换垫料，以减少训练和测试期间的压力或焦虑（除非绝对必要）。

保持小鼠在食物限制状态直到测试结束。在第13-17天，根据估计的食物奖励消耗量（通常<1克食物颗粒）在适应、训练或测试后给予食物。

5. 适应（第13-14天）

从训练开始前2天开始，在黑暗周期下进行适应，使用红光。在室内撒一些来自家笼的脏垫料，以减少新环境带来的压力，使测试室具有熟悉的“家笼”或“自己”的气味（整个训练和测试期间，每只小鼠使用同一个室）。等待内放置一个装有水的干净陶瓷小碗；小鼠如果没有水不会进食。在测试区内放置两个用于食物限制的陶瓷小碗，每个碗中放入一块食物奖励（约20毫克谷物）。将小鼠放入等待区，移开起始门，允许小鼠在室内探索1小时。不断向空陶瓷小碗中添加食物奖励（约20毫克谷物），以鼓励小鼠频繁探索测试区和盆。

6. 训练（第15天）

将小鼠放入等待区，将每个装有食物奖励（约20毫克谷物）的空陶瓷小碗放入测试区，提起起始门。允许小鼠3分钟内取走两个食物奖励。重复此步骤几次。逐渐在后续试验中加入锯末/小鼠笼垫料。允许小鼠3分钟内从每个盆中取走食物奖励，然后结束试验。一旦小鼠从每个盆中取走食物奖励，进行下一个试验。如果小鼠在食物奖励部分覆盖后不尝试挖掘，可以提供提示（例如，将谷物碎屑洒在食物奖励上方，用手指在锯末上按压出凹痕，部分露出食物奖励）。每次试验后继续添加锯末/垫料，直到食物奖励完全覆盖且小鼠能够可靠地在满盆中挖掘找到食物奖励。如果小鼠在训练开始后2小时内未能可靠地在满盆中找到食物奖励，继续进行第二天的训练。保持小鼠在食物限制状态，并在第二天重复此过程。如果小鼠在连续两天内未能挖掘食物奖励，将其排除在实验其余部分之外，并在实验记录中标注为“未能挖掘”。

7. 测试（第16-17天）

第一天测试简单辨别（SD）、复合辨别（CD）、反转1（R1）和同维转移（IDS）。

第二天测试同维转移2（IDS2）、同维转移3（IDS3）、反转2（R2；可选）和异维转移（EDS）。

在测试当天处理时，给予小鼠一块食物奖励，以避免因饥饿而缺乏专注。从此时到测试结束，除了正确选择的奖励外，不再提供任何食物。在测试开始时，使用镊子（限制气味在盆之间的传播）将食物奖励放入表示正确选择的盆中。食物奖励应完全被介质覆盖。为了避免食物奖励的气味提示，在每个阶段开始时在所有盆中撒上谷物碎屑。将小鼠放入等待区，关闭起始门。将盆放在测试室的两侧。当移开起始门并启动计时器时，试验开始。允许每只小鼠3分钟内做出选择。记录每次试验的选择（正确或错误）和选择时间。

注意：“选择”是指尝试在任一盆中挖掘。只有当小鼠移开介质并将鼻子伸进所挖的空间足够深以找到食物奖励，或移开足够的介质以露出食物奖励时，才记录为选择。如果小鼠在3分钟内未做出选择，记录为无选择（错误）。

一旦小鼠在任一盆中做出选择，将未选择的盆从测试室中移除。如果做出了正确选择，允许小鼠吃完食物奖励后再将其放回等待区。如果做出了错误选择，允许小鼠探索盆以显示该选择没有食物奖励，然后将其放回等待区。每次试验结束后，将小鼠放回等待区并重新放置起始门。确保小鼠连续8次正确选择才能进入下一阶段的AST。如果小鼠在50次试验内未能连续8次正确选择，则失败该阶段，不能继续完成测试。连续6次无选择（3分钟内无选择）视为未参与，禁止小鼠进入下一阶段。

小鼠反应时间持续性测试

（repeated Psychomotor Vigilance Task, rPVT）

小鼠反应时间持续性测试是一种用于评估动物警觉性和反应时间的方法。这种测试可以模拟人类的持续性注意力任务，如驾驶或监控系统操作，从而帮助研究睡眠剥夺、药物影响或其他因素对警觉性和反应时间的影响。可评估睡眠剥夺对小鼠警觉性和反应时间的影响；评估药物（如镇静剂、兴奋剂）对小鼠警觉性和反应时间的影响。研究各种神经退行性疾病（如阿尔茨海默病、帕金森病）和精神疾病（如注意力缺陷多动障碍、抑郁症）对小鼠警觉性和反应时间的影响。

选择健康、年龄和体重相近的小鼠，通常使用成年小鼠。在实验开始前，让小鼠适应实验室环境至少一周，以减少环境变化对实验结果的影响。使用带有光敏传感器和奖励系统的操作箱。操作箱通常包含一个或多个响应孔，小鼠需要通过触碰这些孔来响应光刺激。

实验步骤：

1. 初始训练

习惯化：将小鼠放入操作箱中，使其熟悉环境。可以在操作箱中放置少量食物或水，让小鼠自由探索。

基本训练：训练小鼠通过触碰响应孔来获得奖励。例如，每次小鼠触碰响应孔时，给予一小块食物或水作为奖励。

2. 正式测试

测试设置：设定光刺激的出现频率和持续时间。通常，光刺激每隔一段时间（如10秒或30秒）出现一次，每次持续12秒。

测试过程：将小鼠放入操作箱中，开始测试。每次光刺激出现时，记录小鼠的反应时间（从光刺激出现到小鼠触碰响应孔的时间）。

多次测试：进行多次测试，以评估小鼠在不同时间段内的反应时间。通常，测试持续数小时，以模拟长时间的警觉性任务。

评估指标：

1. 正确反应的百分比：这是评估学习效果的主要指标之一。在训练过程中，记录大鼠在给定的前时段（fore period）内正确响应（即在鼻子戳键被照亮时按下按键）的次数，并计算正确反应占总试验次数的百分比。

2. 过早反应的频率：这指的是大鼠在鼻子戳键被照亮之前做出反应的次数。如果大鼠在限定的前时段（fore period）结束之前做出反应，这被认为是过早反应。

3. 错过反应的次数：这指的是在鼻子戳键被照亮后，大鼠没有在有限保持（limited hold，LH）时间内做出反应的次数。

4. 前时段的调整：随着大鼠学习效果的提高，前时段（即从刺激出现到响应窗口开放之间的时间）会逐渐增加。如果大鼠能够在这个延长的前时段内保持高正确反应率，这表明学习效果良好。

5. 反应时间的一致性：评估大鼠在正确试验中反应时间的一致性。一致性高表明大鼠能够稳定地在正确的时间窗口内做出反应。

6. 测试结束时的前时段：记录每次训练测试结束时大鼠达到的最终前时段长度。随着训练的进行，这个值应该逐渐增加，表明大鼠能够处理更长的前时段。

7. 食物赚取量：大鼠在训练测试中通过正确反应赚取的食物量也可以作为学习效果的一个指标。这通常是通过正确反应次数乘以每次正确反应的食物奖励量来计算的。

8. 训练天数：记录大鼠达到学习标准所需的天数。一些大鼠可能比其他大鼠学得更快。

9. 稳定性：评估大鼠在连续几天的训练中表现的一致性。如果大鼠能够在连续的测试中保持高正确反应率和低过早反应率，这表明学习效果稳定。

10. 适应性：评估大鼠对训练参数变化（如前时段、TO和LH的调整）的适应能力。如果大鼠能够快速适应这些变化并维持良好的表现，这表明它们具有较好的学习能力。实时监测大鼠的学习进度。达到预设的学习标准（例如，连续几天保持70%以上的正确反应率）后，大鼠被认为是成功完成了rPVT任务的学习。

• 平均反应时间：所有测试中，小鼠对光刺激的平均反应时间。

• 反应时间变异：反应时间的标准差或变异系数，反映小鼠反应时间的稳定性。

• 错误次数：小鼠未能在规定时间内（如2秒）对光刺激作出反应的次数。

• 遗漏次数：小鼠完全错过光刺激的次数。

• 奖励获取次数：小鼠成功触碰响应孔并获得奖励的次数。

• 活动水平：记录小鼠在操作箱中的总活动距离和活动模式，以评估其整体行为表现。

rPVT训练：

1. 一旦成型，从固定的、相对较短的前时段间隔和TO值开始（例如，2秒），在接下来的30分钟测试中，直到大鼠完成10次正确试验中的8次。在训练期间的每一次试验中，都要在足够长的时间内照亮鼻子戳键，以便大鼠作出反应。在这里，保持按键照亮9秒钟；这个反应窗口也称为有限保持（LH）。

2. 使用相对较短的时间出局（TO；例如，2秒）作为对过早反应或在鼻子戳键照亮之前反应的惩罚。在TO期间，大鼠没有机会获得食物。在这里，TO和前时段值在这些训练测试期间持续时间相同，并以相同的速率变化。

3. 一旦大鼠完成了10次正确试验中的8次，就将前时段和TO增加0.1秒（即，到2.1秒），同时将LH缩短0.1秒（即，到8.9秒）。

注意：在对小鼠进行rPVT训练时，采用更长的ITI，因为小鼠需要更多时间来消耗食物颗粒。在这里，对于训练和测试雄性C57BL/6J小鼠，使用30秒ITI。此外，由于小鼠可能重约20克，它在测试期间会消耗明显更少的颗粒。因此，通过在最多获得50个颗粒时结束测试来缩短典型测试；增加前时段和TO的标准也改为在增加前时段和TO之前完成5次正确试验中的4次。

文献引用：

1.Davis CM, Roma PG, Hienz RD. The Rodent Psychomotor Vigilance Test (rPVT): A Method for Assessing Neurobehavioral Performance in Rats and Mice. J Vis Exp. 2016 Dec 29;(118):54629.

2.Bari, A., Dalley, J. & Robbins, T. The application of the 5choice serial reaction time task for the assessment of visual attentional processes and impulse control in rats. Nat Protoc 3, 759–767 (2008).

3.Birtalan, E., Bánhidi, A., Sanders, J.I. et al. Efficient training of mice on the 5choice serial reaction time task in an automated rodent training system. Sci Rep 10, 22362 (2020).

4.Heisler JM, Morales J, Donegan JJ, Jett JD, Redus L, O'Connor JC. The attentional set shifting task: a measure of cognitive flexibility in mice. J Vis Exp. 2015 Feb 4;(96):51944.

5.Hajnal, M.A., Tran, D., Szabó, Z. et al. Shifts in attention drive contextdependent subspace encoding in anterior cingulate cortex in mice during decision making. Nat Commun 15, 5559 (2024). https://doi.org/10.1038/s41467024498452

6.Remmelink, E., Chau, U., Smit, A. B., Verhage, M. & Loos, M. A one-week 5-choice serial reaction time task to measure impulsivity and attention in adult and adolescent mice. Sci. Rep. 7, 1–13 (2017).

7.Bruinsma, B. et al. An automated home-cage-based 5-choice serial reaction time task for rapid assessment of attention and impulsivity in rats. Psychopharmacology 236, 2015–2026 (2019).

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