Mol Cell | 糖修饰介导的非传统泛素化途径抑制了Nrf1的活化

撰文 | 阿童木

泛素-蛋白酶体蛋白降解途径是细胞内一种重要的蛋白质降解机制，目标蛋白首先通过E1 （泛素活化酶） 活化泛素，泛素活化后结合到E2 （泛素结合酶） 并被转移到E3 （泛素连接酶） 以识别特定的目标蛋白，随后被26S蛋白酶体降解【1】。泛素化通常涉及泛素分子和靶蛋白赖氨酸（K）侧链的ε-氨基基团之间形成异肽键，而除了常规泛素化外，泛素链还可以连接在蛋白质中的丝氨酸（S）、苏氨酸（T）和半胱氨酸（C）残基上【2】。此外，也有报道显示泛素化也会发生在非蛋白质底物上，包括脂多糖、ADP-核糖、糖原和磷脂酰乙醇胺等【3,4】。然而，非典型泛素化的调控机制及生理功能目前仍未完全厘清。

在真核生物中，蛋白酶体基因的表达由核因子红细胞2样1蛋白 （NFE2L1，也称为Nrf1） 诱导【5】。新合成的Nrf1靶向内质网，并发生高度的N-糖基化。在非应激条件下，Nrf1被HRD1持续泛素化并逆转移到细胞质，由肽:N-糖苷酶NGLY1去糖基化，发生蛋白酶体降解。然而，当蛋白酶体活性受损时，Nrf1无法被降解并被转运到细胞核，而在细胞质酶DDI2和NGLY1的调控下，诱导编码蛋白酶体亚基的基因表达，以恢复蛋白酶体的活性，这个反应通常称为 反弹反应（bounce-back response）【5】。其中，DDI2蛋白水解并切割Nrf1，移除N端约100个氨基酸；而NGLY1则从靶蛋白中去除N-糖基，导致糖基化天冬酰胺（N）残基转变为天冬氨酸（D），以上两种Nrf1的序列变化对其激活至关重要。

最近的研究分析了NGLY1缺失细胞和小鼠中SCF E3泛素连接酶复合物 （尤其是FBS2蛋白） 对Nrf1的泛素化作用【6】，发现FBS2能识别并结合N-高甘露糖糖蛋白，导致NGLY1缺失的细胞生长停滞和死亡。额外敲除内-β-乙酰氨基葡萄糖苷酶 （ENGASE） 编码基因可以部分恢复NGLY1缺失小鼠的存活率，表明ENGASE和FBS2是NGLY1缺陷的遗传修饰因子。尽管Nrf1在这些细胞和小鼠中被高度泛素化，但这些泛素化的Nrf1不会被蛋白酶体降解或被DDI2切割，表明SCFFBS2介导的泛素化与传统的HRD1介导的泛素化不同。

近日，日本理化学研究所 （RIKEN）Tadashi Suzuki实验室领衔在Molecular Cell杂志发表了题为Sugar-mediated non-canonical ubiquitination impairs Nrf1/NFE2L1 activation的研究文章，发现Nrf1/NFE2L1的活化受一种由糖修饰介导的非传统泛素化途径的调控。这一非传统泛素化途径通过ENGASE酶去除N-糖基，使Nrf1成为SCFFBS2/FBXO6识别的靶点，并通过形成泛素链抑制了Nrf1的激活。

SKP1-CUL1-F-box (SCF)FBS2/FBXO6是一种识别 N-糖的 E3 泛素连接酶，能够通过识别N-糖基而泛素化Nrf1，然而Nrf1的N-糖基化位点簇周围并没有典型的易发生泛素化的赖氨酸（K）残基，因此作者首先探究了Nrf1在非典型位点发生泛素化的可能性和机制。作者构建了所有K残基被替换为精氨酸（R）的Nrf1突变体 （26KR） ，并在HeLa细胞中与FBS2共同过表达。实验结果表明，即使没有K残基，Nrf1仍被泛素化，且通过NaOH或羟胺处理后这些泛素链被消除，表明它们是通过氧酯键连接在了丝氨酸（S）和苏氨酸（T）残基上。此外，FBS2在Nrf1的N-糖基簇区域识别并进行非K位点泛素化。这种非典型的泛素化方式在NGLY1缺失的细胞中尤为显著，表明在缺乏NGLY1的情况下，Nrf1仍能通过补偿性泛素化逆向转运和被DDI2处理，并最终转运到细胞核。因此，SCFFBS2能够识别Nrf1核心区域的N-糖基簇，并通过氧酯键对非K位点进行非典型泛素化。

进一步研究发现，在NGLY1缺失细胞中，FBS2可以更有效地对Nrf1进行泛素化。而ENGASE的存在则进一步增强了这种泛素化效果，尤其是在NGLY1和ENGASE双敲除的细胞中，FBS2对Nrf1的泛素化完全依赖ENGASE的活性。SCFFBS2通过识别Nrf1上的N-糖基进行泛素化，这种泛素化阻止了Nrf1的DDI2处理和细胞核转运，从而防止了Nrf1上调蛋白酶体基因表达。因此，ENGASE和FBS2共同作用，通过泛素化途径调控Nrf1的活性，甚至影响了细胞对蛋白酶体抑制剂的敏感性。

ENGASE作用于N-糖基中最内层的N,N’-二乙酰几丁二糖部分的糖苷键，生成N-GlcNAc修饰的糖蛋白。由于在不能生成N-GlcNAc残基的NGLY1:ENGASE-dKO和ENGASE-KO细胞中，FBS2介导的Nrf1泛素化几乎不会发生，因此作者推测SCFFBS2可能会泛素化Nrf1上的N-GlcNAc残基。利用化学合成的糖肽和重组蛋白进行了体外泛素化实验后，作者发现SCFFBS2在与ARIH1协同的情况下，可以通过N-GlcNAc和T残基对Nrf1进行泛素化修饰，泛素链通过氧酯键连接，且泛素化主要发生在N-GlcNAc的6位羟基上。

SCFFBS2-ARIH1-UBE2L3对Nrf1的非典型泛素化修饰可能是由于Nrf1的N-糖基化位点附近缺乏赖氨酸（K）残基。为了检查SCFFBS2的经典泛素化，作者合成了GP8，通过用K替代GP1中的N-GlcNAc，发现K连接的泛素化比通过氧酯键实现的泛素化效率显著提高。此外，SCFFBS2主要通过K48连接泛素链，同时也形成了非典型的K6、K33、K11和K29连接链。可见，ARIH1和SCFFBS2对Nrf1的泛素化至关重要，尤其是在非典型泛素链的形成中。此外，利用泛素突变体进行检测后发现，K6、K11、K33和K48残基对于泛素链的复杂组装是必需的。这些结果共同表明，ARIH1和UBE2L3在Nrf1泛素化过程中发挥了关键作用。

接下来作者探究了SCFFBS2依赖性Nrf1泛素化对其蛋白降解的影响。cycloheximide （CHX） 和VCP抑制剂NMS-873处理细胞后，作者发现Nrf1在NGLY1-KO细胞中的降解显著延迟，而在WT和NGLY1:ENGASE-dKO细胞中则无显著变化。在NGLY1-KO细胞中，即使在Bortezomib （Btz） 处理后，泛素化的Nrf1仍然稳定存在于细胞质中，而非聚集体中。进一步分析发现，尽管大部分泛素化蛋白质在DUBs （去泛素化酶） 作用下被去泛素化，泛素化Nrf1上的较短链泛素链对DUBs仍具有一定的抗性。在E1抑制剂MLN7243处理的细胞中，总泛素化蛋白质的丰度显著减少，而Nrf1上的较短泛素链则对去泛素化完全不敏感。最后，通过免疫共沉淀实验发现，部分泛素化的Nrf1仍与SCFFBS2-ARIH1复合物结合，这可能影响了DUBs对泛素链的可及性。这些结果表明，SCFFBS2-ARIH1泛素化修饰的Nrf1在细胞质中保持稳定，且对去泛素化调节并不敏感。

综上所述，本研究揭示了非传统泛素化在调控细胞内蛋白质代谢中的重要角色。通过识别Nrf1上的N-糖基并形成复杂的泛素链，SCFFBS2-ARIH1-UBE2L3复合物能够抑制Nrf1的活化，这一发现拓展了我们对非典型泛素化过程的理解，也为解析NGLY1缺陷症等蛋白质代谢障碍性疾病的发病机制提供了新的思路。

https://doi.org/10.1016/j.molcel.2024.07.013

制版人：十一

参考文献

1. Hershko A., Ciechanover A. The ubiquitin system.Annu. Rev. Biochem. 1998; 67: 425-479.

2. Cadwell K., Coscoy L. Ubiquitination on nonlysine residues by a viral E3 ubiquitin ligase.Science. 2005; 309: 127-130.

3. Otten E.G. et al. Ubiquitylation of lipopolysaccharide by RNF213 during bacterial infection.Nature.2021; 594: 111-116.

4. Sakamaki J.I. et al. Ubiquitination of phosphatidylethanolamine in organellar membranes.Mol. Cell. 2022; 82: 3677-3692.

5. Radhakrishnan S.K. et al. Transcription factor Nrf1 mediates the proteasome recovery pathway after proteasome inhibition in mammalian cells.Mol. Cell.2010; 38: 17-28.

6. Yoshida Y. et al. Loss of peptide:N-glycanase causes proteasome dysfunction mediated by a sugar-recognizing ubiquitin ligase.Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2021; 118e2102902118.

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