PI3KCIIα依赖自噬防止小鼠低剪切力内皮功能障碍和动脉粥样硬化

动脉粥样硬化是一种累及大动脉和中动脉的复杂、多因素性病变，在心血管疾病中占有很大比例。衰老或代谢紊乱在动脉粥样硬化斑块沉积的第一步中损害内皮屏障完整性的主要诱发因素。除了全身因素外，内皮细胞（EC）单层还不断暴露于血流和相关的流体剪切应力中。剪切应力强烈影响 EC 稳态，不同的剪切应力模式决定了动脉粥样硬化病变沿血管树的不均匀分布。

自噬是一种由各种细胞应激诱导的分解代谢过程，它被激活以确保细胞质成分被自噬体隔离并输送到溶酶体进行降解和回收。自噬体的生物发生由 ULK1/PIK3C3 复合物I（VPS34-VPS15-Beclin1-ATG14L）启动，其中 VPS34 是 Ⅲ型磷脂酰肌醇激酶（PI3K-Ⅲ），其催化底物磷脂酰肌醇（PI）磷酸化生成的3-磷酸磷脂酰肌醇（PI3P）为自噬小体形成所必需的。研究表明，自噬程序被激活以响应高流体剪切应力（HSS），诱导内皮保护并预防动脉粥样硬化的发展。相比之下，低流体剪切应力（LSS）在内皮细胞中触发的自噬反应不太明显。然而，尚不清楚 LSS 和 HSS 是否在不同的激活水平上驱动相同的信号通路，或者使用不同的信号模块来控制 EC 功能。

鉴于此，法国 INSERM-图卢兹大学代谢与心血管疾病研究所及意大利都灵分子生物技术中心等的研究团队曾探讨了小鼠体内不同动脉剪切应力区域以及体外流动室中EC的自噬过程，发现动脉内皮 LSS 和 HSS 涉及不同的自噬信号转导模块，需要不同类别的 PI3K。研究工作揭示了 II 类 PI3Kα 在控制自噬中的重要作用，并证明这种机制是由 PI3KCIIα-（磷酸肌醇 3-激酶II 类α）依赖性初级纤毛组装调控驱动的。具体研究成果发表在Arteriosclerosis,Thrombosis, and Vascular Biology期刊题为“PI3KCIIα-Dependent Autophagy Program Protect From Endothelial Dysfunction and Atherosclerosis in Response to Low Shear Stress in Mice”。

首先，为了探索 LSS 驱动内皮自噬过程的潜在机制，研究了 VPS34 和 PI3KCIIα 表达水平在 ECs 对 LSS 的响应。与静态培养的 ECs 相比，LSS（1 dyne/cm²）持续 24h 的 ECs 中 PI3KCIIα 蛋白水平显著升高（图1 A），VPS34 表达水平保持不变（图1 B），表明 PI3KCIIα 优先参与 ECs 对 LSS 的响应。

为了研究这些 PI3Ks 在 LSS 和 HSS 诱导的自噬中的潜在作用，使用小干扰RNA敲低 PI3KCIIα 和 VPS34（图1 C、J），与阴性对照细胞相比，PI3KCIIα 敲低后，LSS 诱导的 LC3B 阳性结构急剧降低，而 VPS34 敲低则没有影响（图1 C）。这些结果在毛细管和蛋白质印迹实验中得到证实（图1 D）。相比之下，HSS（18 dynes/cm2）对 ECs 中 LC3-B 表达的分析表明，敲低 VPS34 导致自噬减少，而敲低 PI3KCIIα 则没有影响（图1 G、H）。

这些结果证明了PI3KCIIα 而非 VPS34 在内皮 LSS-相关自噬机制动员中的重要性，并强调了内皮中不同机械力诱导的分子机制的特异性。

为了进一步研究 PI3KCIIα 在体内动脉疾病背景下 EC 生物学中的自噬功能，建立了载脂蛋白E基因缺失（ApoE−/−）小鼠和PI3KCIIα 杂合缺失（PI3KCIIα+/−）小鼠，发现与 ApoE−/− 小鼠动脉的 LSS 区域相比，ApoE−/−PI3KCIIα+/− 小鼠内皮 LC3B 标志物强度显著降低，而HSS区内皮中 LC3B 表达无变化，表明PI3KCIIα 表达降低会损害体内动脉内皮 LSS 区域的自噬。

接下来，研究了 PI3KCIIα 依赖性自噬去除对 EC 功能的影响。通过分析 PI3KCIIα 杂合缺失对主动脉 LSS 和 HSS 区域 EC 形态的影响（图2 A），发现ApoE−/−PI3KCIIα+/− 小鼠主动脉弓 EC 的大小明显增加（图2 B、C）。PI3KCIIα 表达降低的小鼠中 EC 面积的增加与两种基因型中相同内皮区域主动脉弓细胞数量的减少相关（图2 D）。相比之下，在两种基因型的小鼠的降主动脉中均未发现 EC 大小或 EC 数量的变化（图2 E-G），表明PI3KCIIα 表达降低特异性影响了动脉 LSS 区域的 EC 形态。

由于 EC 的主要功能是维持屏障完整性，因此研究了这种形态变化是否伴随着 LDL（低密度脂蛋白）跨内皮通量的变化。结果表明，PI3KCIIα 的缺失导致体外 ECs 中穿胞作用显著增加（图2 H），表明 PI3KCIIα 是防止胆固醇在内皮下空间沉积所必需的。此外，还观察到 PI3KCIIα 敲低 HUAEC 中 DNA 损伤标记物磷酸化-H2AX 和衰老标志物 p16 表达显著增加（图2 I、J），而 ApoE−/− 与 ApoE−/−PI3KCIIα+/− 小鼠 EC 中促炎细胞因子和炎性粘附分子的表达水平没有改变。这些数据表明，PI3KCIIα 是内皮稳态的重要调节因子，特别是通过自噬在 LSS 区域。

此外，还评估了自噬存在内在缺陷的 ApoE−/−PI3KCIIα+/− 小鼠中的动脉粥样硬化斑块负荷（图2 K），观察到小鼠 LSS 区域的动脉粥样硬化斑块沉积显著增加，但在 HSS 区域则没有（图2 L-N），血浆胆固醇水平也没有变化（图2 O）。这些数据表明，LSS 特异性区域自噬的丧失导致动脉粥样硬化增加。

雷帕霉素复合物1（mTORC1）通路是多种细胞类型中细胞大小和自噬的中心调节因子，并且是不同病理学中众所周知的药物靶点。为了进一步研究上述发现的分子和药理学意义，假设 mTORC1 通路可以将 PI3KCIIα 与内皮细胞的自噬联系起来。为了验证这一假设，在体外 LSS 下评估其效应子 p70-S6 激酶在存在或不存在 PI3KCIIα 下的磷酸化水平来测量 mTORC1 激活水平，观察到PI3KCIIα 的缺失导致磷酸化-p70-S6 激酶水平显著升高，表明mTOR受 PI3KCIIα 负调控（图3 A）。

为了证实这种机制在体内的重要性，评估了 mTOR 的药理学抑制是否可以恢复因 PI3KCIIα 表达降低而改变的内皮功能。将 ApoE−/−PI3KCIIα+/− 小鼠给予依维莫司（mTOR抑制剂）处理（图3 B），发现依维莫司导致在 LSS 区域自噬显著增加（图3 C、D），并恢复 EC 大小（图3 G、H），而对 HSS 区域这两个参数没有任何影响（图3 E、F、I、J），这表明 PI3KCIIα 在控制动脉 LSS 区域的 mTOR 信号传导中的重要性。此外，实验证明了依维莫司处理在 ApoE−/−PI3KCIIα+/− 小鼠中显著减少动脉粥样硬化沉积，表明mTORC1 调控将 PI3KCIIα 与自噬联系起来以响应 LSS，抑制 mTORC1 可以抵消这种病理背景下 PI3KCIIα 的缺失。

最后，为了进一步研究 PI3KCIIα 和 mTOR 调控之间的联系，研究人员探讨了初级纤毛的影响。初级纤毛是一种重要的机械传感器，一些研究描述了 PI3KCIIα 是调控初级纤毛生物合成的关键酶，并证明 mTOR 信号可由初级纤毛激活。实验观察到动脉 LSS 区域的 ECs 上初级纤毛的富集。与ApoE−/− 小鼠动脉的 LSS 区域相比，ApoE−/−PI3KCIIα+/− 小鼠中的初级纤毛数量总体减少，纤毛缩短。这些结果表明，PI3CIIα 控制内皮初级纤毛的生物发生以响应 LSS。

然后敲低纤毛发生关键基因 IFT88 以研究在 PI3KCIIα 缺失的情况下是否会导致体内稳态缺陷（图4 A、B）。在 IFT88 缺失的 EC 中，初级纤毛减少（图4 C），缺乏 LC3B 阳性结构（图4 D），LC3-B 表达降低（图4 E），EC 增大（图4 F、G）。这些结果与在没有 PI3KCIIα 的情况下观察到的结果相似，表明 PI3KCIIα 的缺失模拟了原发性纤毛缺陷表型，表明该激酶可能通过初级纤毛调控 LSS 诱导的自噬和 EC 稳态。

总的来说，该研究结果表明，动脉系统内的机械应力变异性决定了 EC 的自噬反应，对动脉粥样硬化有直接影响。这项工作揭示了 PI3KCIIα/mTOR 是 LSS 区域内皮机械传感的关键调节因子，并阐明了内皮初级纤毛在动脉粥样硬化病因中的重要作用。

参考文献：Nasr M, Fay A, Lupieri A, Malet N, Darmon A, Zahreddine R, Swiader A, Wahart A, Viaud J, Nègre-Salvayre A, Hirsch E, Monteyne D, Perez-Morgà D, Dupont N, Codogno P, Ramel D, Morel E, Laffargue M, Gayral S. PI3KCIIα-Dependent Autophagy Program Protects From Endothelial Dysfunction and Atherosclerosis in Response to Low Shear Stress in Mice. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2024 Mar;44(3):620-634. doi: 10.1161/ATVBAHA.123.319978. Epub 2023 Dec 28. PMID: 38152888.

原文链接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/38152888/或点击阅读原文

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