FSHW | 口服凝结芽孢杆菌TQ-35可缓解OVA敏感BALB/c小鼠的过敏反应

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Abstract

到目前为止，凝结芽孢杆菌已被广泛研究，但对其在过敏中的用途缺乏研究。在这项研究中，旨在评估不同浓度的凝结芽孢杆菌对卵清蛋白 （OVA） 诱导的食物过敏的BALB/c小鼠模型中食物过敏的影响及其对肠道微生物的影响。通过检测对致敏小鼠的症状、特异性免疫球蛋白E（IgE）、T细胞分化及相关基因表达水平的评估表明，高剂量口服凝结芽孢杆菌可缓解过敏症状。在高剂量组中，凝结芽孢杆菌治疗显著降低了IgE和IgG1水平，并调节了辅助性T1型细胞（Th1）和Th2的平衡以及脾脏中相关基因的表达。16S rRNA分析表明，益生菌改善了微生物群的结构，特别是通过提高梭状芽胞杆菌、寻常拟杆菌和屎肠球菌的百分比，以及通过增加微生物物种的丰度，从而调节免疫系统。因此，本研究可为凝结芽孢杆菌剂量在缓解卵巢过敏方面的实际应用提供见解。

Introduction

食物过敏通常对健康人无害，是对特定食物抗原的不良反应。在食物过敏开始时，身体的免疫系统对某些食物蛋白质反应异常，这可能涉及体内的许多系统，导致过敏反应甚至危及生命。食物过敏最严重的症状称为过敏反应，可涉及皮肤、呼吸道和胃肠道紊乱以及心血管异常，并导致危及生命的低血容量性休克和呼吸功能受损。近几年来，随着全球食物过敏发病率逐年上升，已成为全球关注的食品安全和公共卫生问题。数据显示，西方国家的过敏患病率仍然很高，为10%，并且还在上升，其中幼儿的患病率最高，而与此同时，发展中国家的过敏患病率每年都在增加。食物中的蛋白质可以为身体提供营养，但同时也可能引发食物过敏。鸡蛋中的卵清蛋白（OVA）具有很高的研究价值，是蛋清中含量最丰富的蛋白质，含量高达54%。OVA是引起鸡蛋过敏的主要蛋白质。鸡蛋过敏是除牛奶外第二常见的婴儿和儿童食物过敏。

然而，缺乏对食物过敏的强有力的治疗和预防仍然是一个问题。准确避免食物过敏原仍然是唯一有效的方法。然而，避免吃鸡蛋会导致严重的饮食限制。鸡蛋占人们食物的很大一部分，导致经常滥用。因此，迫切需要OVA过敏的替代治疗方案和有效的预防措施，以恢复自然的口服免疫耐受性。

除宿主因素外，饮食和微生物群等环境因素也被证明会影响过敏症状。出于这个原因，人们一直在寻求新的过敏治疗方法。其中，益生菌疗法越来越受到关注。通过益生菌预防食物过敏已被强调为一个有前途的目标。益生菌调节肠粘膜的免疫系统，从而干预食物过敏。益生菌及其代谢物可以通过与免疫细胞和肠道微生物群相互作用来减少食物过敏。另一方面，益生菌给药的持续时间和剂量都会影响食物过敏治疗的结果。因此，益生菌的临床应用仍需进一步研究。

益生菌，有益于受试者健康的活微生物，前提是摄入足够的数量。益生菌通过影响人体胃肠道粘膜和皮肤表面丰富多样的微生物群和免疫系统，可以改善健康并降低疾病风险。因此，益生菌受到了广泛的关注。然而，一些传统的益生菌，如乳酸杆菌、双歧杆菌和酵母菌，具有很好的益生菌功能，但抗性较差。因此，它们无法在人类胃肠道的复杂环境中生存，而且它们的存活率普遍较低。因此，产孢子细菌越来越受到学者的关注。凝结芽孢杆菌是一种产生芽孢杆菌的益生菌，其耐酸孢子使其对胃液和胆盐具有很强的抵抗力，因此对胃肠道环境具有高度耐受性。研究表明，凝结芽孢杆菌通过诱导CD4、Foxp3、Tregs和白细胞介素（IL）-10的产生来改变辅助性T细胞1型（Th1）/Th2/调节性T细胞（Treg）的平衡，从而抑制对虾的致敏作用++。在过去的研究中，与长双歧杆菌相比，凝结芽孢杆菌在缓解虾早肌球蛋白过敏方面的效果相对较差。即使对于相同的益生菌，其治疗由不同蛋白质引起的过敏症状的效果也可能有所不同。研究表明，产乳酸菌可有效缓解OVA引起的过敏，因此推测具有相同功能的凝结芽孢杆菌可能有效缓解OVA过敏。

通过高密度发酵得到高菌落数的凝结芽孢杆菌液体，并通过喷雾干燥制备了凝结芽孢杆菌粉末。本研究旨在比较不同浓度益生菌制剂的有效性，同时研究凝结芽孢杆菌粉对OVA过敏性BALB/c雌性小鼠的影响。另一方面，研究凝结芽孢杆菌粉给药对小鼠肠道菌群的影响。该研究可为凝结芽孢杆菌粉在缓解过敏中的实际应用提供一定的浓度参考，并为该益生菌制剂在食品工业中的实际生产提供理论支持，具有市场应用价值。

Results

益生菌治疗缓解OVA引起的过敏

为了研究不同浓度的凝结芽孢杆菌粉对OVA过敏的影响，建立了OVA致敏的BALB/c雌性小鼠模型。根据过敏症状评分评估，在Ctrl组小鼠中没有观察到过敏体征，与Ctrl组和Ad组相比，OVA组表现出更明显的过敏症状，过敏评分更高（图2A）和肛门温度下降更大（图2B）。同时，只有Ctrl组显示体重增加，而其他组在致敏过程中表现出更明显的体重减轻（图2C）。这些表明这种OVA敏化的BALB/c雌性小鼠模型取得了成功。

在已建立的小鼠致敏模型中引入不同浓度的益生菌制剂，研究不同剂量的凝结芽孢杆菌粉对缓解OVA过敏的影响。与OVA组相比，H-BC组的过敏症状明显减少，肛门温度不同。同时，M-BC组的过敏症状也得到缓解，但并不明显。上述结果表明，不同浓度的凝结芽孢杆菌粉产生的效果不同，但只有高剂量的益生菌制剂能显著缓解OVA引起的过敏。安慰剂组不能有效缓解过敏症状，而凝结芽孢杆菌组可有效缓解OVA过敏。

血清中免疫球蛋白同种型相关抗体活性的下调

OVA作为鸡蛋过敏原之一，通过与过敏特异性IgE结合而诱导，导致各种食物过敏症状。OVA组血清IgE、IgG1水平明显高于Ctrl组和Ad组。该结果可以证明OVA致敏的小鼠致敏模型已经建立成功。口服凝结芽孢杆菌粉可有效降低H-BC组小鼠血清中OVA特异性IgE和IgG1水平（图3）。与H-BC组相比，其他治疗组和安慰剂组的IgE水平变化不大。该结果表明，高浓度的凝结芽孢杆菌可有效缓解OVA过敏，而其他浓度的凝结芽孢杆菌效果较差。H-PL组的IgE水平下降，但无显著影响。它排除了安慰剂对治疗组的影响。随着浓度的增加，安慰剂组小鼠的血清IgE水平逐渐降低，表明安慰剂也具有一定的缓解过敏功能。施用高浓度的凝结芽孢杆菌制剂可减少IgE和IgG1的产生，从而降低OVA和抗体结合水平，并最终缓解小鼠的过敏症状。

益生菌诱导的脾脏CD4 T细胞分化的治疗

在食物过敏过程中，过敏原特异性B细胞被T细胞激活并发育导向，T细胞作为核心调节因子，Th2/Th1比值与过敏反应呈正相关。Th1和Th2细胞分泌代表性细胞因子IL-4和干扰素γ（IFN-γ），通过染色和检测T细胞上的相应抗体可以确定Th1和Th2细胞的数量。Th1细胞的比例在L-PL和M-PL组中显著下调，而其他组相对于这两组几乎没有变化（图4C）。与OVA组相比，Ctrl和M-BC组的Th2细胞比率显著降低（图4D）。对于Th2细胞与Th1细胞的比例，Ctrl组远低于OVA组，而M-BC组下调。安慰剂组的Th2/Th1比率水平适度增长，而M-BC组和H-BC组均有所下降（图4E）。图4A、B显示了每组计数细胞的代表性流式细胞术图像。这些结果表明，在Th1水平保持不变的情况下，给予凝结芽孢杆菌粉通过减少T细胞向Th2的分化来缓解过敏。在给小鼠施用安慰剂组后，Th1和Th2细胞都通过T细胞的分化而减少，导致该比率几乎没有变化。因此，口服凝结芽孢杆菌制剂可以通过影响脾脏中T细胞的分化来缓解OVA诱导的食物过敏。

口服凝结芽孢杆菌粉影响脾脏过敏相关基因的表达

如图5所示，OVA组脾脏中IFN-γ的基因表达较低，而治疗组和安慰剂组均大幅增加。与安慰剂组相比，治疗组有小幅上调，但没有显著差异。Ctrl组和H-BC组IL-4基因表达严重不如OVA组。在治疗组中，它表明粉末剂量的增加，它对IL-4基因表达的降低越多（图5B）。已知IL-4和IFN-γ基因表达的不平衡会影响小鼠的免疫系统，而免疫系统又是过敏症状发展的原因。高浓度益生菌治疗的H-BC组过敏症状得到缓解，IFN-γ基因表达显著上调，IL-4基因表达抑制。如图5C所示，T-bet基因在小鼠脾脏中的表达降低，施用益生菌可以提高该基因的表达水平，但浓度的变化对其影响不大。安慰剂对小鼠脾脏中T-bet基因表达影响不大。GATA3基因表达在OVA致敏小鼠的脾脏中升高，并且在给予益生菌制剂和安慰剂后被调节至正常值。已知GATA3和T-bet在Th2和Th1细胞的分化中具有重要功能。结果，GATA3和T-bet基因表达的改变导致Th1/Th2反应失衡，导致IL激活，从而诱导IgE产生，从而导致食物过敏症状。口服凝结芽孢杆菌可上调T-bet基因表达水平，下调GATA3基因表达水平。BALB/c小鼠致敏后脾脏中的Foxp3基因表达降低。与OVA组相比，M-BC组和H-BC组的Foxp3表达水平略有增加，并且增加与益生菌的浓度成正比（图5E）。Foxp3是一种Treg细胞特异性转录因子，可促进和维持Treg细胞的分化和正常生理功能。Tregs数量减少或功能受损以及Foxp3的异常表达可能导致Tregs对其他Th细胞、肥大细胞和其他效应细胞的抑制减弱，从而促进食物过敏的发展和进展。与致敏组相比，口服凝结芽孢杆菌的小鼠T细胞中Foxp3基因表达更高。它促进了Treg细胞的分化和过敏缓解。

OVA过敏小鼠口服凝结芽孢杆菌调节肠道菌群结构

为了研究系统发育关系，通过将门水平上操作分类单元（OTU）序列的碱基差异与单个OTU序列的物种注释信息相结合，构建了一个物种进化树，如图6A所示。如图6B所示，在肠道菌群丰度最高的10个门级中，治疗组的杆菌和γ变形杆菌比例低于致敏组。但梭状芽胞杆菌和拟杆菌的百分比有所增加。研究发现用两歧双歧杆菌口服治疗的OVA致敏BALB/c小鼠显示出过敏症状的缓解和肠道菌群内杆菌的减少以及梭状芽胞杆菌和拟杆菌的增加。产气荚膜梭菌通过影响上游MyD88依赖性机制来缓解食物过敏，进而诱导新生Treg细胞中转录因子RORgt的产生，并提高对膳食抗原的耐受性。同时，IL-10（一种关键的抗炎细胞因子）的基因表达与γ变形菌的数量呈正相关。

进行LDA评分大于2.0的线性判别分析效应大小（LEfSe）分析，以区分Ad、OVA和H-BC组之间的特定细菌分类群（图7）。图7显示了MBC组和MOVA组之间物种丰度的差异以及差异的大小。与致敏组相比，口服凝结芽孢杆菌的小鼠肠道菌群中寻常拟杆菌、疣微生物菌、巴氏杆菌科和异体菌属显著增加。研究发现，过敏儿童的肠道微生物中缺乏寻常芽孢杆菌。另一方面，疣微生物，巴氏杆菌科和拟普雷沃氏菌属在治疗小鼠的肠道菌群中有所恢复，这反过来又缓解了过敏。

相对于MAd组，用口服凝结芽孢杆菌制剂处理的小鼠的肠道菌群中Lachnoclostridium显著增加（图8A）。斯塔克等人在过敏性BALB/c小鼠中发现微生物群的破坏和Lachnoclostridium的减少。但更重要的是，发现治疗组中的屎肠球菌水平高于MAd和MOVA组。在治疗组中，肠道菌群中屎肠杆菌的数量，用作缓解过敏症状的益生菌，增加，从而改善肠道环境，缓解过敏。Raineya属于拟杆菌属，其数量与肠道菌群中的过敏症状成反比。接触不动杆菌（图8B）可缓解过敏症状。

稀疏度曲线和秩丰度曲线是描述组内样本多样性的常见曲线。MAd组和MBC组的稀释曲线（图9A）趋于平坦，而两组的分层聚类曲线（图9B）的水平轴跨度也大于MOVA组，表明MAd和MBC组的物种丰富度更高。从图9C可以看出，与MOVA组相比，MAd和MBC组具有更高的物种丰富度。如图9C所示，与MOVA组相比，MAd和MBC组的物种丰富度更高。

为了研究肠道微生物群落变化引起的微生物功能变化，对微生物群进行了功能分析。在肠道菌群的功能分析中，治疗组的细胞突和生物系统通路上调，而人类疾病通路减少（图10A）。其中传染病：细菌、其他氨基酸代谢、免疫疾病、免疫系统、能量代谢等，均有功能降低但氨基酸代谢增加，氨基酸代谢有选择性调节平衡（图10B）。与致敏小鼠相比，发现免疫疾病和免疫系统与治疗小鼠过敏症状的一些缓解一致也就不足为奇了。这种现象表明，对OVA致敏小鼠施用凝结芽孢杆菌粉可改善和平衡肠道菌群结构，并对与免疫疾病和免疫系统相关的菌群进行一定的调节。

Discussion

近年来，食物过敏这一严重的食品安全和公共卫生问题越来越受到关注。因此，食物过敏受到越来越多的关注。人们致力于研究如何缓解和治疗食物过敏。有很多治疗方法试图治疗食物过敏，益生菌的使用受到了一些关注。益生菌通过促进免疫细胞分泌调节性细胞因子、调节肠道通透性和粘液厚度以及调节肠道微生物来治疗食物过敏。益生菌的有效性取决于微生物种类或菌株、益生菌细胞的数量和益生菌载体的类型及其衍生的代谢物和副产物。世界代谢疾病组织没有关于益生菌菌株或剂量的建议。先前的研究表明，凝结芽孢杆菌具有一定的缓解食物过敏的能力。然而，在用于治疗食物过敏的凝结芽孢杆菌的细菌数量和粉末剂量方面仍存在一些研究空白。凝结芽孢杆菌通常可有效缓解虾早幼粒细胞过敏，但一些研究表明，产乳酸细菌可以缓解卵形细胞过敏。因此，本研究探讨了口服不同浓度的凝结芽孢杆菌TQ-35对OVA致敏小鼠过敏症状的影响。

在这项研究中，构建了OVA致敏的BALB/c雌性小鼠模型，并有三个不同浓度的治疗组和相应的安慰剂组。通过过敏性临床体征、OVA特异性抗体（IgE和IgG1）、脾脏T细胞分化水平和基因表达水平评估对不同治疗的反应。采用小鼠肠道菌群同步16S rRNA测序，解释凝结芽孢杆菌缓解过敏症状的机制，并探讨其机制。结果表明，高浓度凝结芽孢杆菌TQ-35可缓解OVA过敏症状，提示凝结芽孢杆菌TQ-35可用于治疗OVA过敏。

小鼠OVA过敏的主要症状增加抓挠频率，震颤，呼吸窘迫和腹泻，并伴有肛门温度下降。OVA组的过敏症状和肛门温差明显大于Ad组。他们指出了OVA敏化模型的成功。相比之下，H-BC组小鼠过敏症状减轻，肛门温差降低，表明高剂量的凝结芽孢杆菌缓解了OVA过敏，而M-BC小鼠的症状缓解不显著，表明高剂量的凝结芽孢杆菌更具治疗作用。IgE介导的食物过敏反应诱导B细胞在暴露于过敏原后产生IgE抗体。另一方面，食物过敏促进了Th2亚群细胞的分化，主要介导体液免疫，促进肥大细胞和嗜酸性粒细胞的鉴赏和分化，刺激B细胞分化产生IgG1。目前，血清过敏原特异性IgE水平被用作诊断食物过敏和过敏原筛查的方法。H-BC中OVA特异性IgE和IgG1显著降低，表明高浓度凝结芽孢杆菌可缓解过敏。M-PL和H-PL中的IgG1也有所降低，这表明安慰剂组可以减少IgG1的产生，这可能与Th2细胞分化有关。

T细胞分化结果表明，安慰剂抑制了Th1和Th2细胞的分化。Th2细胞分化和IgG1水平的结果相互印证。IgG1水平可以对Th2细胞水平做出反应。凝结芽孢杆菌可以下调Th2的水平，从而降低IgG1的水平。这两个结果与彼此的趋势一致。治疗组和安慰剂组的比较表明，凝结芽孢杆菌促进Th1细胞分化并抑制Th2分化。总体而言，口服中高剂量凝结芽孢杆菌粉可降低Th2与Th1细胞的比例，表明其缓解了过敏。凝结芽孢杆菌诱导T细胞分化，下调Th2分化，上调Th1分化，从而缓解食物过敏小鼠Th1/Th2免疫失衡。赵的研究发现凝结芽孢杆菌13002可以调节Th2/Th1细胞平衡，提高免疫力。

在基因表达水平上，凝结芽孢杆菌粉和载体通过上调IFN-γ基因的表达来缓解过敏，而高剂量的凝结芽孢杆菌也显著下调IL-4基因的表达，有助于更有效地缓解过敏症状。口服凝结芽孢杆菌粉也增加了T-bet基因的表达，降低了GATA3基因的表达。通过这种方式，凝结芽孢杆菌可以调节过敏相关基因表达的平衡，从而缓解OVA诱导的过敏。T-bet直接抑制IL-4和GATA3功能的表达。同时，GATA3不仅通过诱导Th2细胞因子表达（例如IL-4）抑制Th1分化，还通过抑制IFN-γ和T-bet来抑制Th1分化。Ad组Foxp3基因水平显著下调是由于小鼠耳膜致敏的原理导致小鼠炎症。而M-BC和H-BC组可以增强Foxp3基因的表达。目前的研究表明，Foxp3基因在口腔耐受性中起着至关重要的作用。抗原特异性Foxp3 Treg通过产生细胞因子TGF-β、IL-10和IL-35来抑制肠道固有层中对食物的不良反应。

在免疫系统中，肠道菌群维持体内稳态，肠道菌群的失调促进了食物过敏的严重程度。与健康人群相比，食物过敏患者的肠道菌群组成和功能存在显著差异。研究发现，高浓度的凝结芽孢杆菌增加了肠道中有益于缓解食物过敏的细菌数量，并减少了与食物过敏呈正相关的细菌数量。梭状芽胞杆菌的存在诱导了Treg诱导因子的产生，这些因子可能与树突状细胞合作，诱导Treg在结肠中普遍积累。寻常双歧杆菌的显著增加与其他相关过敏性研究的结果一致。在须藤的书房里，B. vulgatus缓解了抗生素诱导的Th2相关基因的过表达，从而调节了Th1和Th2相关基因的平衡。屎肠杆菌可降低血清中总IgE的产生，并增强T细胞的IFN-γ产生。另一方面，高剂量的凝结芽孢杆菌也增加了肠道菌群的物种丰度，这对维持免疫系统稳态很重要。当肠道菌群具有较高的物种丰度时，肠道菌群的功能完整性和稳定性得到了保证。肠道菌群的类型和丰度影响了肠道菌群的代谢途径，进而影响了过敏症状，其中免疫信号通路和分子机制需要进一步研究。然而，在肠道菌群中未发现凝结芽孢杆菌，这与其他研究一致。凝结芽孢杆菌是一种瞬时细菌，不会在肠道中定植，但可以通过产生乳酸和短链脂肪酸来影响肠道菌群。短链脂肪酸可刺激肠道屏障的形成，促进免疫系统的发育和成熟，作用于T细胞和B细胞等细胞，或通过作用于肥大细胞来减少炎症反应，从而减少食物过敏。同时，免疫系统和与免疫疾病功能相关的微生物群被削弱。

Conclusion

综上所述，凝结芽孢杆菌粉在缓解OVA诱导的食物过敏方面的作用已通过体内实验得到证实。过敏症状评分、细胞分化和基因表达水平表明，只有高浓度的凝结芽孢杆菌才有显著的过敏缓解作用。此外，结合肠道菌群分析了凝结芽孢杆菌缓解OVA过敏的基本原理。本研究对凝结芽孢杆菌的工业实际应用具有一定的参考意义，可为凝结芽孢杆菌缓解过敏的实际用量提供参考。凝结芽孢杆菌对小鼠的日剂量可控制在9×108 CFU用于缓解OVA引起的食物过敏，有助于凝结芽孢杆菌的实际生产和应用，促进益生菌产业的发展。

Oral administration of Bacillus coagulans TQ-35 alleviates allergic responses in OVA-sensitive BALB/c mice

Yifan Wanga, Shanjun Chena, Chong Wanga, Yi Zhangb, Hongliang Zengb, Linglin Fua, Yanbo Wanga,c,*

a Food Safety Key Laboratory of Zhejiang Province, School of Food Science and Biotechnology, Zhejiang Gongshang University, Hangzhou 310018, China

b College of Food Science, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou 350002, China

c School of Food and Health, Beijing Technology and Business University, Beijing 100048, China

*Corresponding author.

Abstract

Bacillus coagulans has been extensively studied so far, but there has been a lack of research on its usage in allergy. In this study, we designed to assess the effect of different concentrations of B. coagulans on food allergy in a BALB/c mouse model of ovalbumin (OVA)-induced food allergy and its effect on gut microbes. The assessment of symptoms, specific immunoglobulin E (IgE), T-cell differentiation, and related gene expression levels in sensitized mice by assay indicated that high doses of oral B. coagulans could alleviate allergic symptoms. Treatment with B. coagulans, in the high-dose group, signif icantly reduced IgE and IgG1 levels and modulated the balance of T helper type 1 cell (Th1) and Th2 and the expression of relevant genes in the spleen. 16S rRNA analysis showed that probiotics improved the structure of the microbiota, in particular by boosting the percentage of Clostridia, Bacteroides vulgatus and Enterococcus faecium, and by increasing the abundance of microbial species, thereby modulating the immune system. Therefore, this study can provide insights into the practical application of B. coagulans doses to alleviate OVA allergy.

Reference:

WANG Y F, CHEN S J, WANG C, et al. Oral administration of Bacillus coagulans TQ-35 alleviates allergic responses in OVA-sensitive BALB/c mice[J]. Food Science and Human Wellness, 2024, 13(3): 1246-1257. DOI:10.26599/FSHW.2022.9250104.

翻译：林安琪（实习）

编辑：梁安琪；责任编辑：孙勇

封面图片来源：图虫创意

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