溶瘤病毒产品非临床研究考量及案例分享

2024年1月25日，溶瘤病毒生物科技公司CG Oncology在纳斯达克上市，当天最高涨幅超过100%，市值超20亿美元。溶瘤病毒再次吸引了医药工业界的目光。溶瘤病毒作为一种新兴肿瘤治疗方式，可选择性地感染肿瘤细胞和/或选择性地在肿瘤细胞中复制以裂解肿瘤细胞，也可同时表达外源基因以提高相应功能，还可通过刺激机体产生免疫反应达到治疗目的，对正常细胞不造成影响。

在20世纪的时候，研究人员主要利用天然病毒的溶瘤作用，但到了21世纪，开始了对溶瘤病毒的基因改造，赋予其更多能力，可以理解为作为“士兵”的溶瘤病毒装备了各种 “尖端武器”。目前已经有4款溶瘤病毒类产品上市，2004年，Rigvir在拉脱维亚获批用于黑色素瘤和其他恶性肿瘤的治疗。2005年，H101在中国获批用于鼻咽癌治疗。2015年，T-VEC在美国获批用于黑色素瘤的治疗。2021年，Delytact在日本获批上市用于恶性胶质瘤的治疗。

溶瘤病毒的主要类型

溶瘤病毒产品包括野生的、减毒的、或经过基因修饰的具有复制能力的病毒产品。溶瘤病毒来自单链或双链 DNA 或 RNA 病毒，其中单链 RNA （ ssRNA ）和双链 DNA （ dsDNA ）较为多见。 dsDNA 病毒主要包括腺病毒（ adenovirus ）、痘苗病毒（ vaccinia virus ）、疱疹病毒（ herpesvirus ）等。 ssRNA 病毒包括柯萨奇病毒（ coxsackievirus ）、塞内卡病毒（ Seneca Valley virus ）、脊髓灰质炎病毒（ poliovirus ）、麻疹病毒（ measles virus ）、新城疫病毒（ Newcastle Disease virus ）、水泡性口炎病毒（ vesicular stomatitis virus ）等。部分溶瘤病毒特征如下图所示。

除了天然野生型，还有一些是基因修饰型的溶瘤病毒。比如将肿瘤细胞过表达的抗原（如 CD20 、 EGFR 、 HER2 等）对应的抗体融合到溶瘤病毒中，增加肿瘤靶向性和选择性，类似为溶瘤病毒安装了“ CAR ”。也有通过敲除某些基因，实现功能调节的目的，比如使病毒不能在正常细胞中复制。或者通过过表达某些基因如细胞因子、蛋白实现增强杀伤能力的目的。举例如下表所示。

溶瘤病毒非临床评价指导原则

专门针对溶瘤病毒这一类产品的特定指导原则很少，有些基因治疗的指导原则将部分类型的溶瘤病毒产品包括在内，还有些指导原则针对的是溶瘤病毒一部分特点，比如溶瘤产品的脱落研究。罗列如下：

1 ） ICH CONSIDERATIONS Oncolytic Viruses （ 2009.10 ）

2 ） ICH Considerations General Principles to Address Virus and Vector Shedding （ 2009.07 ）

3 ） ICH Considerations: General Principles to Address the Risk of Inadvertent Germline Integration of Gene Therapy Vectors （ 2006 ）

4 ） NMPA ：基因治疗产品非临床研究与评价技术指导原则（适用范围包括未通过基因修饰表达特定基因的微生物如溶瘤病毒产品）（ 2021.11 ）

5 ） ICH S12: Guideline on nonclinical biodistribution considerations for gene therapy products(CDE 网站有翻译版 )

6 ） EMA ： Guideline on the quality, non-clinical and clinical aspects of gene therapy medicinal products （ 2018.03 ）

7 ） EMA: Quality, non-clinical and clinical issues relating specifically to recombinant adeno-associated viral vectors （ 2010.06 ）

8 ） FDA: Guidance of industry: preclinical assessment of investigational cellular and gene therapy products （ 2013.11 ）

9 ） FDA: Design and analysis of shedding studies for virus or bacteria-based gene therapy and oncolytic products （ 2015.08 ）

10 ） PMDA: Guidance on quality and safety securing of pharmaceutical products for gene therapy(2013.07)

11 ） PMDA ： Law to maintain the diversity of Organisms through Control of the Use of Genetically-modified Organisms （ 2004.02 ）

当然，ICH M3（R2）、ICH S6和ICH S9等也可以适当参考。张素才等老师发表的《溶瘤病毒类药物非临床安全性评价的实践与思考》也可参考。2015年上市的T-VEC和2021年上市的Delytact相关资料也是不错的参考素材，本文会对这两个案例做下分享。

溶瘤病毒类产品非临床评价具体技术要求

1、选择性

选择性属于主要药效学研究中的一部分。溶瘤病毒对肿瘤细胞的选择性是这类产品需要特别关注的一个点。否则怎么好意思叫“溶瘤病毒”呢。ICH规定，对正常细胞的潜在风险需要在人体试验前评估。对溶瘤病毒来讲，选择性有着两层含义，一是能选择性感染肿瘤细胞，从而进入细胞内部；二是可以在肿瘤细胞中进行复制。故，需重点评估在肿瘤细胞系、非肿瘤正常细胞系中溶瘤病毒的细胞毒性、裂解能力和复制情况。需要注意的是因受体或启动子原因，有些溶瘤病毒在永生细胞系和原代肿瘤细胞中的敏感性有差异，因此如果条件允许，适当采用原代肿瘤细胞进行评价是有必要的。如果实在没有合适的体外感染体系用于评估选择性，就只能伴随在体内试验中进行考察了。

2、动物模型

模型动物选择时应考量溶瘤病毒的亲嗜性、传染性、复制能力、引起细胞病变的能力及抗肿瘤作用。这就对动物模型的选择提出了很大挑战。虽然荷瘤鼠可以用来进行溶瘤病毒的药效概念验证、药代动力学研究、病毒脱落研究和安全性研究，但是溶瘤病毒在动物中的组织感染和复制能力与人体可能有区别。以常见的腺病毒为例，虽然其可以感染异源移植到小鼠中的人体肿瘤细胞，但腺病毒不能在小鼠组织中复制，因此只能部分评估溶瘤病毒的作用。而且，异源移植的荷瘤鼠通常是免疫缺陷的，无法评估机体对溶瘤病毒的免疫反应。小鼠同源模型可以解决免疫缺陷的问题，但要看溶瘤病毒能否感染鼠源肿瘤细胞，并产生活性。

3、生物分布

溶瘤病毒是具备复制能力的，因此需要考察其在正常组织感染和复制的能力，包括每个组织的感染滴度和/或病毒基因组水平。检测方法尽可能灵敏，比如采用Q-PCR技术。如果病毒经过基因改造，改造后基因的表达情况也需要考察。如果可能，可以考虑在动物模型中开展，满足同时考察在靶组织和非靶组织中分布、脱落研究的目的。当然，无论选择模型动物还是健康动物，都必须是生物学层面具备相关性的动物，这样对于指导临床和后续毒理方案设计才有意义。

根据ICH S12，基因治疗产品生物分布试验收集的组织样本或体液至少包括注射部位、性腺、肾上腺、大脑、脊髓（颈、胸、腰）、肝、肾、肺、心、脾和血液。根据产品类型、亲嗜性、作用机制等不同，还可扩展到外周神经、背根神经节、脑脊液、玻璃体、引流淋巴结、骨髓、眼睛和视神经等。

ICH S12特别提到性腺组织的分布，主要担心病毒基因有整合进生殖细胞染色体的风险，或者会对生殖细胞基因组产生影响。涉及到生殖和遗传这一敏感问题，如有分布，具体可参考ICH Considerations: General Principles to Address the Risk of Inadvertent Germline Integration of Gene Therapy Vectors。

4、病毒脱落研究

溶瘤产品通过下述一种或所有途径从患者体内释放：排泄物（粪便）；分泌物（尿液、唾液、鼻咽液等）；或通过皮肤（脓包、伤处、伤口）。脱落不同于生物分布，后者描述的是产品从给药部分扩散至全身，后者描述的是产品从体内排泄或释放。脱落增加了溶瘤病毒从经治个体向未经治个体传播的可能性。虽然从感染性病毒中衍生的溶瘤病毒在研发过程中进行的改造会导致毒力衰减，脱落程度不及母株，但脱落的风险依然存在安全性担忧。

常规采集的样本是尿液、粪便和唾液。如果是皮内给药途径，建议额外采集注射部位的皮肤拭子。如果是吸入或经鼻内途径给药，则建议收集鼻咽洗液。

动物脱落数据应该在临床试验之前开展，有助于预测人体可能的脱落规律。尤其是人类先前未曾暴露于这种产品，例如非人类细菌或病毒株；产品先前曾在人体中给药，但是经过改造，其体内去向完全不同于母株；先前曾在人体给药，但变更给药途径；未曾用于人体，且给药途经不同于自然暴露/感染途径等情况。

脱落试验可以伴随安全性或生物分布试验开展。

5、一般毒理研究

毒理设计的大原则，比如组别设计、动物数量、常规毒理指标等与其它类别生物制品类似，不再赘述，分享几点溶瘤病毒这类产品需要额外关注的。

毒理研究设计时需要考虑溶瘤病毒在组织中的生物分布及持续时间。如果是基因修饰病毒如转基因（IL-2、GM-CSF等），还需要考量转入目的基因的表达情况。如果目的基因，如GM-CSF，在小鼠体内没有活性，可以考虑导入鼠源替代基因，制备替代分子，开展毒理研究。

选择动物种属时，需要考虑溶瘤病毒能否在该种属中正常复制，并能产生预期的病理表现。如果选择采用荷瘤鼠开展安全性评价，需要考虑到肿瘤体积对动物生存寿命的影响。也可考虑采用棉鼠、叙利亚仓鼠、受体人源化动物等开展毒理研究。当然，如果满足溶瘤病毒在体内正常复制、产生生物活性，非荷瘤普通小鼠也可以选用。

如果是非常规给药途经，比如肝内动脉给药，可能选用大动物种属开展研究更为合适。

给药途经和方案应尽可能模拟临床应用场景。对于临床研究中常用的瘤内注射，正常动物可用肌内或皮下注射的方式来代替。

剂量方面，与小分子（高剂量达到预期临床有效暴露量的50倍）和生物药不同（高剂量达到预期临床有效暴露量的10倍），以病毒为载体的基因治疗产品，剂量通常高于临床有效剂量即可（For viral vector based gene therapies, doses are typically at or slightly above the clinically efficacious dose）。但是已经上市的溶瘤病毒给药剂量设计的还是挺高的，比如T-VEC，单次和多次给药高剂量达到了最高临床拟用剂量的60倍，即使药效试验的高剂量也达到临床拟用剂量的30倍，还是力求充分暴露产品的毒性风险。

6、遗传毒性和致癌性

标准的遗传毒性组合试验和传统的致癌试验一般不适用于溶瘤病毒类产品。可在一般毒理研究中伴随考察产品的致瘤风险。

7、非临床package

有个日本团队对日本、欧洲和美国溶瘤病毒产品首次临床试验之前的非临床研究内容要求进行了对比，如下表所示。总体看，各国监管机构对关键研究的要求大体是一致的，不一致的估计就高不就低了。

8、案例

T-VEC

T-VEC （ talimogene laherparepvec ），商品名 Imlygic ，由 Amgen 开发， 2015 年被 FDA 批准用于转移性黑色素瘤的治疗。 T-VEC 是以单纯疱疹病毒（ herpes simplex virus ， HSV ）为载体，敲除 HSV-1 中的 ICP34.5 和 ICP47 两个基因，并在 ICP34.5 基因位置引入 GM-CSF 。与野生型 HSV-1 相比，敲除 ICP34.5 可以使神经毒力降低 10000-1000000 倍。如下图所示， T-VEC 是将野生型 HSV-1 中的两个 ICP34.5 全部去除，并以 GM-CSF 代替。而 ICP47 位点的敲除，则可以增加 MHC-Ⅰ 的递呈，增加病毒和肿瘤抗原的识别，增强 T 细胞免疫。

T-VEC 的作用机制有两种，一是通过注射在局部肿瘤灶，病毒颗粒感染和杀伤周边肿瘤细胞，二是肿瘤细胞裂解后释放肿瘤新生抗原，结合病毒内包含 GM-CSF ，增强系统免疫反应和远端肿瘤杀伤。

T-VEC 可以通过皮肤、皮下及淋巴结病灶部位进行瘤内注射。临床给药剂量为，首剂量最多 4*106PFU ， 3 周后给予最多 4*108PFU ，后续每 2 周给予最多 4*108PFU ，具体剂量视肿瘤体积而定。

主要药效学研究

体外药理主要研究内容： 1 ）验证了肿瘤中 US11 的表达（主要与 ICP47 敲除机理相关）； 2 ） ICP47 对 MHC-Ⅰ 表达的影响（还是验证 ICP47 这个基因位点的功能）； 3 ）在不同细胞对比 T-VEC 与野生 HSV-1 病毒增殖能力； 4 ）对人结肠癌、人胰腺癌、人 / 小鼠肺癌细胞系的细胞毒性研究； 5 ）对人和大鼠前列腺癌细胞裂解能力研究；

体内异源移植瘤模型： HT-29 、 U-87MG 、 Pharynx 三种肿瘤 CDX 模型的安全性及抗肿瘤作用研究；

体内同源肿瘤模型：对 A20 、 CT26 等小鼠同源移植瘤模型的安全性及抗肿瘤作用研究。

药代动力学研究

1 ） SC 和 IV 单次给药后 BALB/c 小鼠组织分布研究

15 只 / 性别 / 组，共 3 组，分别是阴性组、 SC 给药组和 IV 给药组，给药剂量均为 0.6*107PFU/mL 。分别于给药后第 24h 、 14 、 28 、 56 、 85 天，处死动物，每个时间点处死 3 只 / 性别 / 组。收集尿液、血液及各组织， qPCR 检测病毒 DNA 。试验同时进行了抗 HSV 抗体分析。结果显示， SC 给药系统清除需 28 天， IV 给药需 56 天。

2 ）瘤内注射后小鼠组织分布研究

A20 接种小鼠后，体积 100mm3 左右分组，瘤内注射 T-VEC ， 50 μ L/ 小鼠， 1*105PFU/mL 、 5*105PFU/mL ， 8 、 14 、 91 三个时间点收集样本。结果发现， T-VEC 主要在肿瘤、血液和免疫相关组织存在。

3 ） CT26 瘤内注射病毒后“泄露”程度和持续时间研究（结果未见泄露）

4 ） A20 模型瘤内注射病毒后 GM-CSF 水平研究

毒理学研究

1 ） BALB/c 小鼠皮下给药毒性研究

Non-GLP 研究。 20 只 / 性别 / 组，共 3 组，前两组给 T-VEC ，剂量分别是 1*106PFU/mL 、 1*107PFU/mL 。第三组给的是 mouse GM-CSF 基因替代的 T-VEC 。第 1 、 4 、 7 、 10 、 13 天右侧皮下给药。 D43 处死动物。未见毒性。

2 ） BALB/c 小鼠重复给药毒性、组织分布和 56d 观察期试验

试验偏离太多，如血、尿收集失败，动物缺水、缺食，供试品不够，导致后续重新开展的研究。

3 ） BALB/c 小鼠重复给药毒性、 qPCR 组织分布和 24h 、 28d 或 56d 观察期试验

4 ） BALB/c 小鼠重复给药毒性、 qPCR 组织分布和 24 h 、 4 周或 12 周观察期试验

5 ） BALB/c 小鼠重复给药毒性和 24h 或 4 周的观察期试验

比较转入人源 GM-CSF 和鼠源 GM-CSF 的溶瘤病毒安全性区别。

6 ）单次给予雄性 Beagle 犬前列腺的急性毒性试验

安全性和生物分布研究

7 ） BALB/c 小鼠静脉给药的胚胎 - 胎仔发育毒性试验

还有些其它研究毒性机制的试验如雌性 BALB/c 小鼠鼻内给药的神经毒力试验，小鼠颅内给药安全性研究等，不再细表。

Teserpaturev

Teserpaturev 商品名 Delytact Injection ，由日本第一三共开发， 2021 年被日本 PMDA 批准上市，用于恶性胶质瘤的治疗。与 T-VEC 类似，也是采用的单纯疱疹病毒（ herpes simplex virus ， HSV ）为载体。敲除 HSV-1 中的 2γ34.5 和 α47 两个基因，并通过插入来自大肠杆菌的 lacZ 基因失活了 ICP6 基因。 34.5 和 47 两个位点基因与 HSV-1 在正常细胞的复制相关（ T-VEC 给出的解释是降低毒力，增强免疫）。 ICP6 失活也是为了增强肿瘤细胞的选择性以及抗肿瘤作用。

Delytact 临床给药剂量为 1 × 109 PFU ，给药体积为 1mL ，瘤内注射。首次和第二次给药间隔 5-14 天，后续间隔 4 周，最多给药 6 次。

Delytact 作用机理有两点： 1 ）选择性在肿瘤细胞复制，并杀伤被感染细胞； 2 ）死掉的肿瘤细胞释放抗原，进一步激活 T 细胞，增强抗肿瘤免疫反应。逻辑与 T-VEC 类似。

主要药效学研究

体外药理： 1 ）人肿瘤细胞体外杀伤活性研究； 2 ）对阿昔洛韦敏感性研究； 3 ）在多种人神经胶质瘤、胶质瘤、头颈鳞癌、前列腺癌细胞系中的复制研究（提交的文献数据）； 4 ）对多种人恶性黑色素瘤、人胶质瘤、小鼠神经胶质瘤、人前列腺癌细胞系的杀伤作用研究（提交的文献数据）； 5 ）在多种人肿瘤细胞系中对 MHC-Ⅰ 表达的影响研究（提交的文献数据）； 6 ）对肿瘤反应性 T 的刺激作用研究（提交的文献数据）。

体内药理： 1 ）人胶质细胞 U87MG 异源移植瘤模型； 2 ）小鼠神经胶质瘤 Neuro2a 同源移植模型； 3 ）人前列腺癌细胞 HONDA 异源移植瘤模型； 4 ）小鼠前列腺癌细胞 TRAMP-C2 同源移植模型； 5 ）小鼠乳腺癌细胞系 M6c 皮下移植和脑内移植瘤模型； 6 ）小鼠自发性乳腺癌模型； 7 ）小鼠自发性 2 型神经纤维瘤模型； 8 ）人神经鞘瘤小鼠异源移植瘤模型。

药代动力学研究

A/J 小鼠颅内单次给药生物分布研究：主要在中枢神经系统分布。

未开展病毒脱落研究。推测与 HSV-1 病毒脱落背景数据比较多有一定关系。而且与 T-VEC 的改造策略也有相似之处。

毒理学研究

1） 小鼠单次颅内给药毒性研究。

2 ）未开展重复给药毒性研究。虽然本品临床为多次给药，第一三共解释与给药途径是脑实质给药相关。

3 ）其它毒性评价：整合进染色体风险评估（未开展研究，进行了风险解释）；成瘤风险评估（未开展研究，进行了风险解释）；生殖和发育毒性（未开展研究，进行了风险解释）；局部耐受性（未开展研究，进行了风险解释）。

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