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铜是生物体内一种重要的微量元素。铜离子可以作为辅因子参与生物体内多种酶的形成。因其具有氧化还原活性，铜可以参与细胞内的氧化还原反应，细胞呼吸和自由基的清除。在生理条件下，铜在个体中的稳态必须受到严格的调控。由ATP7A基因突变导致的个体铜缺乏会诱发门克斯疾病 （Menkes disease） ，而由ATP7B突变导致的个体铜水平超标会诱发威尔逊氏疾病 （Wilson’s disease） 。在细胞水平，过量的铜会诱导细胞发生铜死亡。铜死亡是近年发现的一种新型细胞死亡方式。细胞内过量的铜离子会诱导细胞呼吸作用中的蛋白聚沉，抑制细胞呼吸，同时导致铁硫簇蛋白的减少，最终诱发细胞死亡。然而，铜离子通过何种方式进入细胞，导致铜死亡以及铜死亡在生理水平的调节意义尚不清晰。
2024年8月6日，北京生命科学研究所/清华大学生物医学交叉研究院的王晓东实验室与郑三多实验室合作，在Cell Metabolism上发表题为Zinc transporter 1 functions in copper uptake and cuproptosis的研究论文。该项研究首次发现并证明了Zinc transporter (ZnT1) 作为新型的铜离子转运蛋白，介导铜离子进入细胞并诱发铜死亡，并阐述了ZnT1 在肠上皮细胞中通过介导铜离子吸收，维持肠上皮Lgr5阳性干细胞稳态。该研究还为临床上用锌离子治疗铜过量引起的威尔逊氏疾病，提供了理论依据。
在之前铜死亡的研究中，铜离子主要是通过小分子载体携带进入细胞内部。本研究中，研究人员通过使用高浓度CuSO4直接处理HeLa细胞，诱发铜死亡。在此基础上，研究人员通过CRISPR-Cas9全基因组功能缺失筛选，鉴定到锌离子转运蛋白ZnT1是铜死亡发生的必需基因。对ZnT1敲除的HeLa细胞进行CuSO4处理不能引发铜死亡，而回补表达ZnT1则可以重建铜死亡。通过ICP-MS质谱鉴定细胞内元素含量发现，相比于野生型HeLa细胞，ZnT1敲除细胞内Cu元素水平显著降低。进一步在体外脂质体实验中发现，Cu2+可以进入整合有ZnT1蛋白的脂质体内部，淬灭Calcein荧光分子，而不能进入不整合ZnT1蛋白的脂质体。这些实验证明了ZnT1具有直接转运Cu2+的功能。
在后续的研究中，研究人员通过冷冻电镜结构解析与功能实验验证，揭示了Zn²⁺和Cu²⁺在ZnT1中共享主要的结合位点。Zn²⁺会竞争Cu2+与ZnT1的结合，从而有效抑制Cu²⁺转运和铜死亡。这项结果提示，临床上通过补充锌离子治疗威尔逊氏疾病，很可能是由于Zn²⁺抑制了ZnT1转运Cu2+来抑制铜吸收，从而缓解威尔逊氏疾病的症状。
通过结构的比对分析，研究人员还发现，相比于其他锌离子转运蛋白家族 （ZnT family） 的成员，ZnT1更倾向于形成一种外向型构象 （Outward-facing conformation） 。这主要是由于在ZnT1二聚体中，一个单体跨膜结构域的螺旋2与另一单体跨膜结构域的螺旋3通过丝氨酸残基与谷氨酸残基形成氢键，进而稳定了外向型构象。此外ZnT1在胞外区以一种特有的亚基间二硫键，加固了这种外向型构象，更有利于铜离子的捕获和吸收。在细胞实验中，向ZnT1敲除细胞系回补上述残基的ZnT1突变体，相比于回补野生型ZnT1，均在一定程度上抑制了铜死亡，证明了ZnT1的外向型构象对于铜离子转运的功能是至关重要的。
动物实验证明，肠上皮细胞中ZnT1蛋白缺失会导致小鼠锌离子吸收缺陷，从而导致小鼠死亡，但这种表型在补充锌离子后则不会发生。同时，ZnT1缺失抑制了肠上皮从血液中吸收铜，最终导致肠上皮铜含量降低，血清中铜含量升高。此外，研究人员还发现， ZnT1转运铜离子的功能对于维持Lgr5阳性肠干细胞是必需的，ZnT1的缺失会导致Lgr5阳性肠干细胞受损，而这一表型不能被外源锌离子的补充所拯救。
综上所述，本研究首次发现了锌离子转运蛋白ZnT1介导铜离子转运并参与铜死亡调节。通过结构解析，提出锌离子竞争性抑制铜离子转运的分子机制，并进一步阐述了ZnT1采取一种外向型构象 （Outward-facing conformation） 保证了铜离子的捕获与吸收。这为临床上通过锌离子治疗威尔逊氏疾病提供了有力的理论依据。在生物体内，ZnT1转运铜离子的功能，对于肠道干细胞的维持具有重要意义。
王晓东研究员和郑三多研究员为本文的共同通讯作者，王晓东实验室的博士后李叶华和郑三多实验室的博士研究生马佳豪为本文的共同第一作者，其他作者还包括王晓东实验室的博士研究生王睿，黎斌实验室的博士研究生罗袁涵宇。
https://doi.org/10.1016/j.cmet.2024.07.009
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