厦门大学夏宁邵等开发检测戊型肝炎病毒的新方法

人类肠道病毒(HEV)可引起从轻微到潜在危及生命的一系列疾病。HEV的鉴定和基因分型对疾病管理至关重要。然而，现有的分型方法有固有的局限性。开发具有更多病毒类型、高准确性和灵敏度且易于获取的HEV检测替代方法是一项技术和分析挑战。

2024年8月1日，厦门大学夏宁邵、张师音、葛胜祥共同通讯在Nature Communications在线发表题为“Sequence-specific nanoparticle barcode strategy for multiplex human enterovirus typing”的研究论文，该研究提出了一种序列特异性纳米颗粒条形码(SSNB)方法，用于同时检测10种HEV类型。

该方法通过解决多个引物组之间的交叉干扰，显著提高了灵敏度，比传统的多重杂交基因分型(MHG)方法提高了10-106倍。此外，SSNB方法在准确区分10种不同的HEV类型和其他流行的临床病毒方面显示出100%的特异性。在对70份临床咽拭子样本的分析中，SSNB方法对阳性样本的检出率(50%)略高于RT-PCR方法(48.6%)。此外，利用测序方法进一步评估SSNB阳性样本的分型准确性，一致性率为100%。该方法的高敏感性和特异性，以及可进行多种类型分析的能力和与临床工作流程的兼容性，使其成为一种有前景的临床工具。

肠道病毒属是小核糖核酸病毒科中最常见的一种，包括四种HEV (EV-A、B、C和D)。已经确定了300多种不同的肠道病毒血清型，可引起各种疾病，包括呼吸道、皮肤、神经系统和胃肠道疾病。每年，估计有超过10亿例新的肠道病毒感染；其中一些病毒，如EV71和CVA16，在亚洲和欧洲造成了多次手足口病暴发，而EV-D68的流行与北美和欧洲的严重呼吸系统疾病有关，偶尔会导致急性弛缓性脊髓炎。戊型肝炎的广泛流行及其引起严重感染的能力迫切需要监测和鉴定与这些相似或不同临床表现相关的戊型肝炎类型。

已经开发了各种HEV基因分型技术；然而，这些都有局限性。病毒中和试验是费时费力的，并且无法识别和表征一些新型戊型肝炎临床分离株。RT-PCR提供了一种快速、灵敏的HEV检测方法，有报道称该方法能够检测多种HEV类型和更高的HEV检测通量。然而，这种方法具有固有的局限性，因为随着多重反应中引物数量的增加，引物二聚体形成的机会增加，从而影响检测灵敏度。此外，PCR荧光通道数量少，不适合多类型检测方法的发展。尽管核酸杂交能够基于不同HEV类型中高度特异性基因序列的特征实现更多靶标的检测，但该方法的敏感性和特异性都不如RT-PCR。VP1衣壳蛋白基因的部分测序是HEV分型的金标准；然而，这种技术相对昂贵，周转时间长，需要专门的生物信息学设施和具有高水平专业知识的人员，这在临床环境中通常无法用于HEV检测。因此，开发高精度、高灵敏度的多重HEV基因分型方法仍是一项挑战。

HEV基因分型的SSNB概述示意图（图源自Nature Communications ）

研究展示了一个能够在单管中以高灵敏度检测和分型10种HEV的SSNB平台。该HEV基因分型平台包括一个由序列特异性纳米颗粒编码的条形码，并涉及颗粒相表面扩增和扩增子介导的双标记探针解码，以实现多重原位HEV基因分型。与液相扩增中的传统自由状态引物不同，类型特异性引物与不同的纳米颗粒共价结合。这些空间固定引物大大减少了自由状态引物相互作用导致引物-二聚体形成的可能性，从而使SSNB具有多重扩增能力，同时保持极高的灵敏度。由于DNA模板化反应的序列特异性，共价连接的引物仅在完全匹配的靶标存在的情况下与捕获链结合并触发随后的扩增反应。一方面，用双标记探针标记的纳米粒子只有在其表面存在扩增子时才会被标记。由于双序列特异性DNA结合反应，SSNB表现出优异的特异性。

研究使用的纳米颗粒具有独特的荧光特性，纳米颗粒本身及其表面的荧光信号可以通过Luminex生产的常用临床仪器识别，并且一次多达500个纳米颗粒与仪器配对可以进行准确识别，理论上可以对500种不同的HEV类型进行基因分型。SSNB平台具有敏感性、特异性、多路复用能力以及与临床常规仪器的兼容性等优势，可为HEV的诊断和治疗以及地区层面感染人群监测的合理决策提供依据；因此，在疫情控制和流行病学调查中具有重要意义。

参考消息：

https://www.nature.com/articles/s41467-024-50921-w#Abs1