中科院1区: 南中医大&河北中医大揭示贯叶连翘缓解抑郁机制

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导读

肠道微生物群失调对抑郁症的进展有显著影响。贯叶连翘（HPL）在欧洲传统上用于治疗抑郁症，然而，其机制在很大程度上仍未得到充分探索。本研究旨在分析与HPL抗抑郁作用相关的关键肠道微生物群物种和微生物代谢产物；采用粪便微生物群移植来评估HPL是否通过改变肠道微生物群来缓解抑郁；使用16S rRNA基因测序和代谢组学分析检查了对照组、慢性束缚应激（CRS）诱导的抑郁症和HPL给药小鼠的微生物群和代谢谱，并通过代谢物和细菌干预实验评估了肠道微生物群对HPL抗抑郁作用的影响。HPL以依赖于肠道微生物群的方式显著缓解了抑郁症状，并通过富集嗜黏蛋白阿克曼菌（AKK）恢复了肠道微生物组成。代谢组学分析表明，HPL调节色氨酸代谢，降低微生物群产生的犬尿氨酸（KYN）水平，增加5-羟色氨酸（5-HTP）水平。补充KYN激活了NFκB-NLRP2-Aspase1-IL1β通路，并增加了抑郁症小鼠海马中的促炎IL1β。AKK单定植显著增加了5-羟色胺（5-HT），降低了KYN水平，通过调节NFκB-NLRP2-Aspase1-IL1β通路改善了抑郁症状。因此，HPL在治疗抑郁症方面的潜在作用主要归因于其对NFκB-NLRP2-Aspase1-IL1β通路的调节，特别是通过靶向AKK和色氨酸代谢产物。

亮点：

1. 贯叶连翘通过调节肠道微生物组成减轻抑郁。

2. 贯叶连翘可以富集嗜黏蛋白阿克曼菌，调节色氨酸代谢。

3. 贯叶连翘可以促进5-羟色氨酸的产生。

4. 贯叶连翘可以通过抑制犬尿氨酸的产生来减轻神经炎症。

5. 贯叶连翘通过NFκB-NLRP2-Aspase1-IL1β途径减轻抑郁。

论文ID

原名：Hypericum perforatum L. attenuates depression by regulating Akkermansia muciniphila, tryptophan metabolism and NFκB-NLRP2-Caspase1-IL1β pathway

译名：贯叶连翘通过调节嗜黏蛋白阿克曼菌、色氨酸代谢和nfκb-nlrp2-caspase1-il-1β通路减轻抑郁

期刊：Phytomedicine

IF：6.7

发表时间：2024.07

通讯作者：刘鄂湖，翁泽斌，郭龙

通讯作者单位：南京中医药大学&河北中医药大学

实验设计

实验结果

1. HPL对CRS小鼠显示出显著的抗抑郁作用

整个实验方案如图1A所示。在3周的模型建立期后，与对照组相比，每天接触CRS的小鼠表现出明显的抑郁样行为。与对照组相比，CRS小鼠在糖水偏好实验（SPT）期间的蔗糖消耗量减少（图1B），在强迫游泳实验（FST）和悬尾实验（TST）期间的不动时间显著增加（图1C-D）。在服用HPL（100、250和500mg/kg）3周后，CRS引起的抑郁症状以剂量依赖的方式得到有效缓解。这些行为测试结果证实了CRS模型的成功建立以及HPL对抑郁症状的减轻。此外，HPL的抗抑郁作用与阳性对照盐酸舍曲林（SER）相当。我们进一步评估了HPL对血清和海马中单胺递质浓度的影响。HPL显著提高了海马和血清中的5-HT水平，如SER，在CRS建模后表现出显著下降（图1E-F）。此外，HPL显著逆转了CRS小鼠海马中5-HT转运蛋白Sert表达的降低（图S2A）。CRS显著增加了血清LPS、IL1β、TNFα和IL6，同时降低了IL10水平。HPL将这些炎症因子逆转至对照水平（图1G-K）。此外，我们在HPL处理的小鼠海马中观察到炎症相关基因（Il1β、Nlrp2、Caspase1和Il6）的表达显著降低（图S2B-F）。Il22、Zo1和Occludin的表达增加表明肠道屏障功能的改善（图1L-N），表明HPL可以增强肠道屏障功能障碍并改善结肠损伤。

图1 HPL对CRS小鼠显示出显著的抗抑郁作用。将小鼠随机分为6组（n=12）。模型组（每天用PBS vehicle给药）、SER组（每天给药SER 10mg/kg）、HPL-L/M/H组（每天服用HPL 100/250/500mg/kg）。（A）显示实验设计和时间线的示意图。（B）HPL治疗3周后的SPT结果。各组小鼠FST（C）、TST（D）的不动时间。（EF）血清和海马5-羟色胺水平，每组n=8。（G-K）血清中涉及LPS、IL1β、TNFα、IL6和IL10的炎症因子水平，每组n=8。（L-N）结肠中紧密连接蛋白（Il22、Zo1和Occludin）的相对mRNA表达，每组N=6。

2. HPL以肠道微生物群依赖的方式减轻CRS小鼠的抑郁

为了研究HPL对CRS诱导的抑郁症的保护作用是否由肠道微生物群介导，我们每天将HPL处理或CRS供体的微生物群转移到患有CRS的受体小鼠身上（图2A）。定植3周后，与CRS受体（F.M.）相比，HPL处理的受体（F.H.）在SPT中的蔗糖消耗量显著增加（图2B），在FST和TST中的不动性显著降低（图2C-D）。伴随着这些行为变化，5-HT水平、Sert mRNA表达（图2E、图S3A-B）、IL10（图2F）增强，LPS和IL1β减少（图2G-H），重现了HPL治疗小鼠的表型。此外，F.H.小鼠的炎症基因（Il1β、Nlrp2和Caspase1）表达降低（图S3C-E），Il22、Zo1和Occludin mRNA表达增加（图2I-K）。相比之下，CRS接受者（F.M.）的抑郁样行为没有改善。这些发现表明，HPL对抑郁症的改善作用可以通过调节肠道微生物群来实现，从而证实了肠道微生物群介导HPL对CRS诱导抑郁症的保护作用。

图2 HPL以肠道微生物群依赖的方式减轻CRS小鼠的抑郁。将小鼠随机分为五组（n=7-10）。模型组（PBS vehicle）、HPL组（500mg/kg）、FM组（来自模型组的微生物群）、FH组（来自HPL组的微生物群落）。（A）说明实验设计和时间线的图表。（B）用HPL或模型/HPL组处理的微生物群给药3周后的SPT结果。各组小鼠FST（C）、TST（D）的不动时间。（E）海马5-羟色胺水平。（F-H）血清中LPS、IL1β和IL10等炎症因子的水平。（I-K）结肠中紧密连接蛋白（Il22、Zo1和Occludin）的相对mRNA表达，每组n=6。

3. HPL缓解CRS诱导的肠道生态失调

考虑到肠道微生物群有助于HPL对CRS小鼠的有益作用，因此必须通过16S rRNA基因测序分析CRS和HPL处理后终点粪便样本中的肠道微生物群组成。与模型组相比，HPL显著降低了Chao指数，但对Shannon指数没有统计学上的显著影响（图3A-B），表明HPL改变了CRS小鼠的物种丰度。我们基于UniFrac的PCoA揭示了对照组、模型组（CRS）和HPL组之间微生物群组成的明显聚类模式（图3C）。CRS小鼠中Akkermansia的相对丰度显著降低，而Dubosiella和葡萄球菌的丰度增加。HPL处理增加了Akkermansia、双歧杆菌、Parabacteroides和拟杆菌的相对丰度（图S4A-C）。然后我们比较了CRS和HPL处理改变的特定属，使用Mann-Whitney U检验确定了Control_vs._Model和Model_vs._HPL组之间丰度存在显著差异的前30个细菌属，并对这些属进行了进一步分析，以确定HPL处理引起的具体变化。热图分析揭示了HPL处理后肠道微生物群组成的实质性重塑（图3D）。与对照组小鼠相比，CRS小鼠在30个属中表现出显著变化（13个减少，17个增加），而补充HPL导致了健康状况的转变。HPL显著增加了Akkermansia的相对丰度（图3E，对照组19.74%，模型组1.65%，HPL组19.05%；p=0.0020），CRS小鼠的相对丰度显著降低，变化最为明显。重要的是，RDA结果表明，Akkermansia与抑郁症相关指标（FST、TST、TNFα、LPS和IL1β）的严重程度呈负相关，表明Akkermanasia富集可能参与HPL对抑郁症的保护作用（图3F）。这些结果表明，HPL调节CRS小鼠的肠道微生物群，导致微生物群组成与对照组小鼠相似，特别是通过富集Akkermansia的丰度。

图3 HPL缓解CRS诱导的肠道生态失调。经过3周的药物干预后，获得小鼠的结肠内容物进行16S rRNA分析。HPL组为HPL-H（500mg/kg）（每组n=8）。（A）Chao多样性和（B）不同组肠道微生物群的Shannon多样性。（C）加权UniFrac PCoA分析。（D）采用Kruskal-Wallis H检验，对照组、模型组和HPL处理组前30个属之间的显著差异热图（p<0.05）。（E）属水平的细菌分类分析。（F）使用RStudio分析了细菌属（由HPL改善）丰度与CRS诱导的抑郁相关症状（SPT、海马5-HT、IL10、IL1β、TNFα、LPS）之间的RDA分析。

4. HPL逆转CRS小鼠的KYN和5-HTP水平

为了评估HPL引起的肠道微生物群重塑引起的代谢变化，我们使用UPLC-Q-TOF/MS生成了血清和粪便样本的非靶向代谢组学图谱。主成分分析（PCA）模型揭示了对照组、模型组和HPL组代谢物的不同聚类模式（图4A-B）。在Control_vs._Model组（图4C）和Model_vs._HPL组（图4D）之间，血清和粪便代谢组中共鉴定出110种代谢物，VIP值>1，p<0.05（Mann-Whitney检验）。HPL给药部分逆转了CRS诱导的代谢物变化，使粪便和血清代谢组与对照组小鼠的代谢组更接近（图4E）。这些代谢物的途径富集分析强调了色氨酸代谢、酪氨酸代谢、糖酵解/糖异生和氨酰-tRNA生物合成等主要途径在CRS诱导抑郁症及HPL的调节中发挥重要作用（图S5A）。在这些改变的代谢物中，有8种被鉴定为色氨酸代谢物，包括KYN、色氨酸和5-HTP。这些发现表明，HPL显著调节CRS小鼠的色氨酸代谢。我们通过Spearman相关性分析进一步研究了关键CRS诱导的抑郁参数（SPT、5-HT、TNFα、LPS和IL1β）与不同代谢产物变化之间的相关性。色氨酸代谢物如KYN、吲哚-3-醛和吲哚在HPL处理小鼠中减少，并与抑郁标志物呈正相关。相反，我们在HPL组中观察到色氨酸、5-羟色氨酸，吲哚丙酮酸和吲哚-3-乙酸的增加，与抑郁标志物呈负相关（图4F）。为了进一步证实HPL对色氨酸代谢的影响（图4G），我们测量了参与色氨酸代谢的关键酶吲哚胺2,3-双加氧酶（Ido）、色氨酸羟化酶1（Tph1）和色氨酸羟化酶2（Tph2）的基因表达水平。结果表明，CRS显著上调了结肠中的Ido表达，下调了结肠和海马中的Tph1和Tph2表达，而HPL显著降低了Ido表达并增加了Tph1和Tph2表达（图S5B-D）。此外，我们发现HPL给药的受体（F.H.）和HPL处理中涉及色氨酸代谢的关键酶的基因表达水平相当（图S5E-G）。这些发现证明了HPL对CRS小鼠色氨酸代谢途径的有效调节，显著降低了KYN水平（图S5H），同时提高了5-HT水平（图2E），并且可以通过肠道微生物群转移复现。

图4 HPL逆转CRS小鼠的KYN和5-HTP水平。经过3周的药物干预（第21天）后，获得小鼠的血清和粪便样本进行代谢组学分析。HPL组为HPL-H（500mg/kg）（每组n=8）。（A-B）主成分分析（PCA）评分图，用于区分血清和粪便代谢组与对照组、模型组和HPL组。通过OPLS-DA和Mann-Whitney检验，对照组（C）、模型组（D）小鼠粪便代谢组学的火山图显示了VIP值>1和p<0.05的代谢物异常值。（E）由CRS改变然后由HPL调节的差异代谢物的热图。（F）使用RStudio分析了差异代谢物（HPL改善）丰度与CRS诱导的抑郁相关症状（SPT、海马5-HT、IL10、TNFα和LPS）之间的RDA分析。（G）色氨酸分解代谢对宿主生理的机制。

5. HPL减轻KYN诱导的神经炎症和抑郁症状

考虑到与模型组相比，KYN在色氨酸代谢物中表现出最显著的变化，HPL给药组KYN丰度的降低可能通过FMT复现。随后，我们将2mg/kg的KYN腹腔注射到小鼠体内，以确认其在与抑郁样行为相关的神经免疫信号网络中作为促炎代谢产物的功能。先前的一项研究表明，升高的KYN产生会激活NFκB，然后NFκB转移到细胞核中并与NLRP2启动子结合，从而增强NLRP2转录和随后炎症因子IL1β的激活，导致抑郁症。

我们的数据显示，与对照组小鼠相比，腹腔注射KYN显著降低了SPT中的蔗糖消耗率，延长了FST和TST中的不动时间（图5A-C），还降低了海马中的5-HT水平以及海马和结肠中的Sert表达（图5D，图S6A-B）。此外，注射KYN显著提高了LPS和IL1β水平，降低了IL10水平（图5E-G）。促炎因子如Il1β、Nlrp2和Caspase1的海马基因表达同时增加，促进了海马神经炎症（图5H-J）。免疫印迹结果进一步证实，KYN显著抑制了抑郁小鼠海马中的炎症相关因子NFκB、NLRP2、Caspase 1和IL1β（图5K）。此外，KYN给药破坏了肠道屏障的完整性，如Il22、Zo1和Occuldin表达降低所示（图S6C-E）。HPL逆转了KYN注射引起的抑郁样行为，使5-HT水平正常化，并通过抑制NFκB-NLRP2-Aspase1-IL1β通路改善了炎症，突显了HPL在缓解抑郁症中的重要作用。

图5 HPL减轻KYN诱导的神经炎症和抑郁症状。KYN组（腹腔注射2mg/kg KYN），HPL组（连续21天每天服用500mg/kg），每组n=10。（A-C）每组小鼠的SPT、FST、TST结果。（D）海马5-羟色胺水平。（E-G）血清中LPS、IL1β和IL10等炎症因子的水平。（H-J）海马组织靶基因（Il1β、Nlrp2和Caspase1）的相对mRNA丰度，每组n=6。（K）海马中Caspase1、NLRP2、P-p65和IL1β蛋白表达的蛋白质印迹，每组n=3。

6. HPL介导的AKK富集减轻CRS小鼠的抑郁症状

在本研究中，阿克曼菌被确定为应对HPL和缓解CRS诱导的抑郁的关键物种（图3F）。AKK的快速表征得益于阿克曼菌属，该属的多样性相对有限。结果表明，HPL处理后AKK水平增加了十倍以上（图3E）。考虑到黏蛋白对阿克曼菌的生存和增殖至关重要，我们随后研究了HPL对黏蛋白产生基因表达的影响。HPL处理后，黏蛋白产生基因（Muc2、Muc3和Muc4）的表达明显上调（图6A）。此外，AKK和HPL处理之间存在显著的正相关关系，16S rRNA测序数据中AKK的相对丰度与qPCR验证一致（图6B）。为了进一步探索AKK在缓解抑郁方面的潜在作用，我们通过口服灌胃给CRS诱导的抑郁小鼠服用AKK 3周。与HPL干预类似，与未补充AKK的小鼠相比，补充AKK导致SPT中蔗糖消耗量增加，FST和TST中的不动时间缩短（图6C-E）。为了证实AKK在HPL的抗抑郁作用中起着重要作用，我们研究了口服AKK后其对小鼠色氨酸代谢和炎症相关途径的影响。结果表明，AKK处理提高了海马中的5-HT水平，降低了KYN水平（图6F-G），分别由IDO和TPH2通路介导。基因表达分析显示，AKK处理的小鼠Ido显著降低，Tph1、Tph2和Sert表达增加（图S7A-E）。此外，AKK显著提高了血清中的IL10，同时降低了IL1β和LPS浓度（图6H-J）。qPCR和蛋白质印迹分析证实，AKK显著改善了CRS小鼠的肠屏障功能（图S7F-H），并通过抑制NFκB-NLRP2-Aspase1-IL1β通路减轻了CRS小鼠海马的炎症反应，从而缓解了抑郁症状（图S7I-K，图6K）。我们在F.H.小鼠中观察到类似的蛋白质印迹结果（图S7L），证实AKK确实对HPL的抗抑郁作用至关重要。

图6 HPL介导的AKK富集减轻了CRS小鼠的抑郁样症状。模型组（PBS vehicle）、HPL组（500mg/kg）、AKK组（1.0×108 CFU/10g），每组n=7-10。（A）结肠黏蛋白相关基因的相对mRNA表达，每组n=6。（B）每组小鼠粪便中AKK物种的相对DNA表达。（C-E）每组小鼠的SPT、FST、TST结果。（F-G）海马5-HT和KYN水平。（H-J）血清中IL10、IL1β和LPS等炎症因子的水平。（K）海马IDO、Caspase1、NLRP2、P-p65和IL1β蛋白表达的蛋白质印迹，每组n=3。

抑郁症的特征是与神经调节系统紊乱相关的炎症性疾病，表现为情绪低落、缺乏兴趣、快感缺失和无助。由于目前可用的抗抑郁疗法的局限性，需要疗效更高、不良反应更少的改良药物。新兴研究表明，HPL可以通过影响与神经炎症相关的因素、增强单胺类神经传递和神经发生以及改变肠道微生物群来改善抑郁行为。HPL被广泛用于治疗轻度至中度抑郁症，含有活性成分，如双蒽酮衍生物（如金丝桃素及其衍生物）和黄酮类化合物（如金丝桃苷、芦丁、槲皮素、槲皮苷和木犀草苷）。然而，其确切的作用机制在很大程度上仍然未知。

抑郁症的主要病因理论是单胺假说，认为在神经传递过程中缺乏神经递质（特别是血清素、去甲肾上腺素和/或多巴胺），从而导致抑郁症状。新的证据表明，肠道微生物群可以合成5-HT和5-HTP，这进一步影响了抑郁症的治疗。5-HTP增强中枢神经系统中的5-HT合成，避免其无法穿过血脑屏障。先前的研究表明，HPL的功能与三环类抗抑郁药和选择性5-羟色胺再摄取抑制剂相似，但副作用较轻。与先前的研究结果一致，我们的数据表明，HPL可以提高结肠和海马中TPH的表达，促进色氨酸转化为5-HTP。这一过程显著促进了5-HTP进入血液的运输，可能使其进入大脑并增强5-HT的产生。

图7 贯叶连翘通过调节嗜黏蛋白阿克曼菌、色氨酸代谢和NFκB-NLRP2-Aspase1-IL1β途径减轻抑郁

越来越多的临床和实验证据表明，外周和中枢促炎细胞因子的增加、单胺类神经递质的失调以及肠道微生物多样性的减少是抑郁症发病的原因。最近的研究表明，肠道微生物群、抑郁行为和海马循环促炎细胞因子（IL6、IL1β、TNFα）之间存在显著关联。HPL具有抗炎和抗氧化作用，通过抑制NFκB通路改善抑郁症状。NFκB信号通路在抑郁症病理中起着关键作用，其激活导致IL1β、IL6和TNFα等促炎细胞因子的过度表达。我们的研究结果证实了炎症在抑郁症中的关键作用，揭示了抑郁症小鼠海马区明显更高的炎症反应。炎症因子IL6、TNFα、IL1β和LPS在抑郁小鼠血清中显著升高，但在HPL处理后显著降低。

抑郁症与肠道微生物群组成、丰富性和多样性的改变有关。接受抑郁症患者粪便微生物群的无菌小鼠或抗生素处理的小鼠表现出类似抑郁的行为，同时伴随着碳水化合物和氨基酸代谢中的微生物和代谢紊乱。我们的数据提示了一种潜在机制，即破坏的微生物组会增加肠道通透性，通过细菌内毒素暴露导致全身炎症。这种破坏也可能引发肠道和海马体KYN产生的改变，引发炎症反应，导致抑郁。在本研究中，我们发现HPL通过肠道微生物群的调节影响循环和海马中的神经递质产生。将HPL处理小鼠的肠道微生物群转移到CRS小鼠可以缓解抑郁样行为和海马神经炎症，同时也会影响色氨酸代谢，包括色氨酸转化为KYN和5-HT。补充KYN可诱导小鼠的抑郁样行为和海马神经炎症，表明生态失调通过色氨酸代谢途径与抑郁发展有因果关系。

IDO在连接免疫系统和KYN通路中起着关键作用。IDO的缺失或抑制可减轻LPS诱导的慢性炎症，维持肠道黏膜屏障的完整性，并调节脑和结肠中的色氨酸代谢。KYN通路的激活破坏了其神经保护和神经毒性分支之间的平衡。先前的研究表明，KYN是神经免疫信号网络中的促炎代谢产物，通过激活NFκB-NLRP2-Aspase1-IL1β通路介导抑郁样行为。在这项研究中，我们发现抑郁症与增强的肠道IDO活性有关，这会使色氨酸代谢从吲哚衍生物转向KYN的产生。色氨酸通过IDO转化为KYN的增加同时减少了其通过TPH转化为5-HTP的增加，从而可能加速抑郁症的发作。因此，我们发现了HPL在精确调节肠道色氨酸代谢方面的新功能，这显著影响了抑郁症的微生物群依赖性调节。我们的研究结果表明，HPL具有作为IDO抑制剂的潜力，靶向色氨酸KYN代谢以缓解抑郁症状。

此外，我们的研究表明，HPL通过显著提高阿克曼菌属水平，有效缓解了CRS小鼠的抑郁样症状。AKK是阿克曼菌属唯一的养殖物种，有助于维持健康的肠道屏障和调节免疫力。正如之前报道的那样，AKK还可以限制炎症的发作，炎症是许多疾病的根本原因。我们的研究结果与这些发现一致，表明AKK通过改善肠道屏障功能、增加5-HT水平、降低KYN和抑制NFκB-NLRP2-Aspase1-IL1β通路在缓解抑郁样行为中的作用。先前的研究报告称，多酚和黄酮类化合物间接刺激肠道黏蛋白分泌，促进阿克曼菌属生长。我们的研究结果表明，HPL可能通过刺激宿主肠道黏蛋白的产生来增强阿克曼菌属，成为阿克曼菌属的唯一碳源和氮源。因此，我们推断HPL的抗抑郁作用涉及纠正微生物群失调、促进神经递质平衡和抑制促炎反应。

综上所述，我们的研究结果表明，HPL中的活性成分，如黄酮类和多酚类，显著提高了AKK的丰度。AKK的增加显著抑制了色氨酸代谢途径中的IDO活性，导致KYN产生减少。因此，NFκB-NLRP2-Aspase1-IL1β通路的激活减弱，导致海马中炎症标志物IL1β的显著减少，从而缓解抑郁症状。此外，AKK水平的升高也可能增加5-HTP的产生，从而提高海马中的5-HT水平，进一步缓解抑郁症状。

结论

总之，本研究表明，HPL通过调节肠道微生物组成和色氨酸代谢发挥了显著的抗抑郁作用，为其治疗抑郁症的机制提供了新的见解。

https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/38996505/

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