斑马鱼行为篇（58）：骨质疏松斑马鱼模型

斑马鱼收集和培养

控制斑马鱼的昼夜时间14h∶10h，在前一天的16时取健康的斑马鱼，按雌雄鱼1∶1比列放入繁殖箱，隔板繁殖，第二天早上光照开始时去隔板交配繁殖，并于10时收集受精卵，置于培养皿中，加入培养基(0.17mmol/LKCl，5mmol/LNaCl，0.33mmol/LMgSO4，0.33mmol/LCaCl2，5%～10%亚甲基蓝)，置于恒温箱中培养，温度(28.5±0.5)℃。

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造模方法

选取健康受精后72h的斑马鱼幼鱼，分成4组，每组3孔，每孔10条，分别给予醋酸泼尼松龙25、50和100μg/mL浓度，并设置正常对照组，依次放入12孔板中28．5℃恒温抚育;每24h换液体积的50%，观察并记录斑马鱼幼鱼的死亡个数，通过死亡个数和总斑马鱼个数比值得到死亡率，培育至144h，使用0．2%的钙黄绿素染色45min，之后用90mg/mL的MS-222对斑马鱼进行麻醉，在体式荧光显微镜下放大50倍进行观察，拍照并计算斑马鱼脊椎荧光染色的个数，通过死亡率及脊椎荧光染色的个数来明确泼尼松龙对斑马鱼的最佳造模浓度(其中死亡率低且诱导骨质疏松作用明显为最佳造模浓度)。

补肾运脾方对泼尼松龙诱导的斑马鱼骨质疏松模型的作用随机选取72h正常斑马鱼于12孔板中，每组3孔，每孔10条，用25μg/mL泼尼松龙处理建立斑马鱼骨质疏松模型，分别给予低、中、高浓度(25、50、100μg/mL)的补肾运脾方，同时设置正常和阳性对照组依替二膦酸钠(300μg/mL)。28.5℃培养箱孵化至144h后，进行染色观察，拍照并计算斑马鱼脊椎荧光染色的个数、脊椎硬骨染色面积(Area)和第1～3脊椎椎体的荧光强度(S)，以评价补肾运脾方对斑马鱼骨质疏松的治疗作用。补肾运脾方对斑马鱼骨质疏松治疗作用计算公式如下:

骨质疏松治疗作用(%)=S(实验组)-S(模型组)/S(正常对照组)-S(模型组)×100%

通过对各浓度的泼尼松龙引起斑马鱼幼鱼死亡率结果显示，泼尼松龙在25μg/mL时，未引起斑马鱼死亡，当浓度为50、100μg/mL时，死亡率分别为20%、50%;通过对椎体个数的比较，25μg/mL的泼尼松龙能显著诱导斑马鱼骨质疏松的产生，故本实验设置泼尼松龙的最佳造模浓度为25μg/mL。

与空白对照组比较，明显发现模型组头骨、椎体发育明显受抑，部分幼鱼出现明显椎体缺失或脊柱畸形，同时加入补肾运脾方干预的斑马鱼出现骨骼缺陷的程度和数量明显减少，说明该方有效减缓了糖皮质激素对斑马鱼骨骼发育的抑制作用，体现出抗骨质疏松效应，且有正性的剂量-疗效趋势。

斑马鱼模型在常见骨疾病研究中的应用

骨质疏松是以骨量减低、骨显微结构退化、骨脆性增高、易发生骨折为特征的全身代谢性骨疾病，而糖皮质激素是引起骨质疏松、增加骨折风险的常见因素。2006年，BarrettR等首次采用不同浓度泼尼松龙作用不同时间，创建斑马鱼骨质疏松模型，并最终确定泼尼松龙建模的最佳浓度为25μM，最佳暴露时间为斑马鱼受精后4～5h，且连续作用5d;随后还验证了药物RU486和双膦酸盐作用于骨质疏松模型后，斑马鱼骨量得到恢复，进一步表明糖皮质激素发挥作用是通过糖皮质激素受体介导的，也为目前广泛应用于骨质疏松治疗的双膦酸盐提供了实验数据。而后，有国外研究人员利用此动物模型，对目前常用药物阿仑膦酸钠和依替膦酸钠的抗骨质疏松药效进行了实验室药效评价，证实其与临床应用一致。而Siccardi等在1月龄斑马鱼的饮食中添加不同浓度的锶盐，采用Micro-CT检测12周后的骨密度，发现随锶盐浓度增加，骨密度亦相应增加。这些研究都与临床研究结果一致，亦提示斑马鱼骨质疏松模型对骨质疏松的治疗具有临床用药指导价值。国外研究还发现，使用糖皮质激素可导致斑马鱼鱼鳞再生的缺损，且成骨细胞和破骨细胞中与骨质疏松相关基因的表达改变，与骨质疏松的病理机制一致。自2012年后，国内的研究团队也分别建立了地塞米松、泼尼松龙诱导的斑马鱼骨质疏松模型，先后用此类模型对西药依替膦酸二钠，中药淫羊藿、续断的代表成分以及复方接骨汤进行了抗骨质疏松活性评价，并采用计算斑马鱼头骨矿化面积等数据，检测淫羊藿黄酮对骨骼生长的促进作用，进一步揭示斑马鱼骨质疏松模型可用于高通量筛选防治骨质疏松的药物，对临床的指导具有合理性。

参考文献：

• Power and challenges of using zebrafish as a model for skeletal tissue imaging[J]. Bart Bruneel;;Paul Eckhard Witten.Connective Tissue Research,2015(2)

• Prednisolone induces osteoporosis-like phenotype in regenerating zebrafish scales[J]. E. Vrieze;;M. A. H. J. Kessel;;H. M. Peters;;F. A. T. Spanings;;G. Flik;;J. R. Metz.Osteoporosis International,2014(2)

• 王小琦,孙岩,张洋,等.斑马鱼模型在常见骨疾病研究中的应用[J].中国比较医学杂志,2017,27(06):86-91.

• 徐宇,黄维琛,郭礼跃,等.补肾运脾方对糖皮质激素性骨质疏松斑马鱼模型骨代谢的调节作用[J].中药药理与临床,2019,35(03):138-141.

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