外泌体与抗肿瘤免疫治疗

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前言

外泌体是纳米级的囊泡，来源于细胞内溶酶体，可以穿梭传递多种生物分子，如核酸、蛋白质、脂质、氨基酸和代谢物，在调节细胞间通讯中起着关键作用。

作为肿瘤微环境中最丰富的免疫细胞之一，肿瘤相关巨噬细胞（TAM）受到肿瘤微环境的影响，发挥促进肿瘤生长、免疫抑制、血管生成和癌细胞扩散等功能。外泌体在介导肿瘤微环境中肿瘤细胞与TAM之间的细胞间信息传递发挥着重要的功能，这可能为抗肿瘤治疗提供新的靶点。

外泌体

1981年，外泌体首次被描述为由不同细胞类型在体外分泌的纳米囊泡，其脂质成分不同于质膜，表明与简单的膜出芽相比，其来源不同且更复杂。外泌体几乎可以由所有类型的细胞分泌，包括免疫细胞、血液细胞、神经元细胞、上皮细胞以及癌细胞。它们含有通过生物发生过程从原始细胞中保留下来的蛋白质，此外，外泌体还可以包含miRNA、mRNA，甚至长的非编码RNA（lncRNA），它们显著参与外泌体的调节作用。

外泌体的生物活性物质可以通过两种主要方式影响受体细胞的代谢。第一种是外泌体表面蛋白与靶细胞受体的直接相互作用。第二种是内容物的内化，在与目标细胞的质膜融合后，或通过内吞、巨噬细胞吞噬。外泌体具有重要的临床意义，尤其是在肿瘤中。

外泌体的主要作用是在有机体细胞之间传递信息。它们通过调节细胞的生存能力、状态和功能，更普遍地参与细胞和组织的内环境平衡，并且它们可以显著地介导组织修复。外泌体也有助于肿瘤的发生和发展，包括正常细胞转化为恶性细胞以及血管生成。

肿瘤相关巨噬细胞

TAM在功能上是异质性的，分为两个主要亚群，M1和M2巨噬细胞。在对脂多糖（LPS）、IFN-γ和GM-CSF的反应中，M1巨噬细胞经历经典激活并优先分泌抗菌分子和促炎细胞因子，包括活性氧（ROS）、一氧化氮（NO）和IL-6。M1巨噬细胞是抵抗微生物感染的第一道防线。M1巨噬细胞还保持强大的抗原呈递能力，诱导强烈的Th1反应。

相反，M2巨噬细胞受IL-4、IL-13、IL-10和CSF-1的作用经历选择性激活，并优先分泌抗炎细胞因子，包括转化生长因子β（TGF-β）、IL-10以及蛋白酶（如精氨酸酶-1和MPPs）。M2巨噬细胞在限制免疫反应、诱导血管生成和组织修复方面起着关键作用。因此，M2样TAM的存在与促肿瘤活性相关，而M1样TAM的存在与抗肿瘤活性相关。

TAM通过分泌促炎症介质，如TNF-α和ROS，创造有利于肿瘤启动的诱变微环境。另外， TAM通过分泌趋化因子CCL22以招募Treg，通过分泌TGF-β，来增强Treg的功能。人类TAM还分泌表皮生长因子（EGF）以增强肿瘤细胞的侵袭性。TAM均上调MMP，MMP降解间质胶原，上调胶原的合成和组装，以重塑TME，有利于肿瘤细胞的侵袭。

肿瘤源性外泌体对TAM极化的调控

许多研究已经证明，肿瘤源性外泌体在单核细胞源性巨噬细胞转化为调节性巨噬细胞以及通介导癌症相关炎症和肿瘤发展中起着至关重要的作用。

外泌体蛋白

研究表明，一些治疗性融合蛋白可以被周围细胞吸收，从而影响肿瘤的进展。一种新的融合蛋白Rab22a-NeoF1与其结合伙伴PYK2可被外泌体传递，通过激活RhoA促进细胞迁移和侵袭，促进M2极化以促进肺转移前生态位的形成，从而导致骨肉瘤细胞的肺转移。这些发现提供了一种新的治疗策略，通过iRGD肽阻断转移，从而消除Rab22a-NeoF1与其结合蛋白的关联。

来源于肿瘤细胞的外泌体还含有免疫调节和促血管生成蛋白，可增强免疫抑制和血管生成能力。例如，与凋亡前列腺癌细胞共培养可增加巨噬细胞中乳脂球EGF因子8（MFG-E8）的表达，其在组织和血清外泌体中高表达，最终抑制促炎症反应并刺激巨噬细胞极化为M2表型。

除极化外，肿瘤来源的外泌体还可介导单核细胞分化为M2巨噬细胞。例如，多形性胶质母细胞瘤（GBM）的外泌体，在这些外泌体中检测到多种丰富的蛋白质，包括硫酸软骨素蛋白多糖4、α-2-巨球蛋白、乳黏蛋白、EGFR和整合素，诱导单核细胞分化为免疫抑制M2表型。

外泌体不仅可以分别诱导巨噬细胞向M1或M2方向分化，而且还可以诱导“混合”表型，“混合”表型可能有助于多种促肿瘤功能。

外泌体miRNA

近年来，大量研究表明，外源性miRNA在肿瘤进展中起着关键作用，刺激血管生成并促进转移。此外，肿瘤源性外泌体miRNA使巨噬细胞极化并靶向多种信号通路，从而对肿瘤进展产生积极或消极的影响。

例如，携带来自CRC细胞的miR-203的外泌体被并入单核细胞，以及CRC细胞衍生的外泌体携带miR-145和miR-934被巨噬细胞摄取，均被极化为M2表型；结肠癌细胞或胶质瘤分泌的外泌体可传递miR-1246并诱导抑制性免疫微环境。

此外，肿瘤细胞源性外泌体中的miRNA在调节巨噬细胞的重编程和M1极化方面也起着重要作用。例如，含有miR-130或miR-33的外泌体增加了TAM的M1特征基因（IRF5、MCP1、CD80）的表达和细胞因子（IL-1β和TNF-α）的分泌，通过将M2转化为M1表型，从而抑制肿瘤进展。

外泌体lncRNAs

新的研究表明， lncRNAs通过不同的信号途径在肿瘤发生、巨噬细胞活化和极化中起着关键的调节作用，lncRNA介导的TAM和癌细胞之间的串扰有助于肿瘤的发展。

例如，lncRNA RPPH1从CRC细胞源性外泌体转移到巨噬细胞，介导巨噬细胞的M2极化，增加波形蛋白和Ki67的表达，降低E-钙粘蛋白的表达，从而促进癌细胞的转移和增殖。

外泌体circRNA

有研究表明，CircRNA在巨噬细胞分化和极化中发挥作用。例如，circASAP1被认为是抑制性miR-326和miR-532-5p的竞争性内源性RNA，直接靶向MAPK1/CSF-1，并通过激活miR-326/miR-532-5p-MAPK1/CSF-1途径介导TAMs浸润。肿瘤源性外泌体携带的circRNA的研究尚处于早期阶段，其在TME调节中发挥的作用还有待进一步研究。

TAM源性外泌体对肿瘤的影响

TAM释放的外泌体作为细胞间通讯的重要介质，也通过TME传递蛋白质、ncRNAs和脂质等物质，赋予癌细胞不同的表型，在肿瘤的发生和转移中起着至关重要的作用。

外泌体蛋白

研究表明TAMs衍生的外泌体对肿瘤细胞有非常关键的影响。例如，整合素αMβ2（CD11b/CD18）存在M2巨噬细胞来源的外泌体中，并且具有显著的特异性和有效性。将外泌体介导的CD11b/CD18蛋白从TAM转移到HCC细胞可激活MMP-9信号通路，并增强细胞的迁移能力，以支持肿瘤迁移。此外，载脂蛋白E（ApoE）主要富集于M2极化的巨噬细胞和M2衍生的外泌体中，M2巨噬细胞衍生的外泌体介导M2巨噬细胞向胃癌（GC）细胞的细胞间传递，维持M2外泌体ApoE之间的连接，导致PI3K/Akt信号通路激活以重塑细胞骨架，并促进GC细胞迁移。

外泌体miRNA

TAMs浸润与骨肉瘤（OS）转移和生长有关。miR-221-3p的过度表达增强了OS细胞在体外和体内的生长，而TAMs中miR-221-3p富集的外泌体通过激活SOCS3/JAK2/STAT3途径加剧了OS细胞的恶性行为，如增殖、集落形成、迁移和侵袭。

已经证明TAMs有利于肿瘤血管生成，来源于M2巨噬细胞的外泌体在体外和体内均可促进小鼠主动脉内皮细胞（MAEC）的血管生成。此外，RNA测序和qPCR分析证明，M2巨噬细胞源性外泌体中含有miR-155-5p和miR-221-5p，可以转移到MAEC中。这些发现证实了TAM通过外泌体与肿瘤血管生成之间的相互作用。

外泌体lncRNAs

与miRNA类似，多个lncRNAs也直接或间接参与微环境与肿瘤细胞之间的串扰。例如，lncRNA AFAP1-AS1可通过M2巨噬细胞源性外泌体并转移至KYSE410细胞，然后下调miR-26a水平并上调ATF2的表达，从而促进食管癌的侵袭和体外肺转移。

此外，TAM通过外泌体传递髓系特异性lncRNA，HIF-1α稳定的长非编码RNA（HISLA），以促进BC细胞的有氧糖酵解和耐药性。

外泌体脂质

研究发现，COX1和TXA合成酶1（TBXAS1）在TAM外泌体中显著富集，在MC38外泌体中几乎检测不到；转染TAM 外泌体的MC38细胞被诱导产生TXB2，表明TAM衍生的外泌体传递TXs合成所需的酶。这些结果证实了外泌体介导的功能性脂质从巨噬细胞向肿瘤细胞的转移最终有助于癌细胞存活。

基于外泌体的肿瘤免疫治疗

基于外泌体的疗法正在出现，是抑制肿瘤进展或增强抗肿瘤免疫的前沿策略。研究表明，外泌体可以很容易地跨越生物屏障，如血脑屏障，并且可以对其进行修饰以提高效率。由于其转移能力、脂质双层结构和独特的表面蛋白质，外泌体可作为药物、核酸和蛋白质的纳米颗粒载体用于受体癌细胞。

鉴于巨噬细胞在外泌体介导的串扰中起着至关重要的作用，调节巨噬细胞是肿瘤治疗的有效策略。外泌体可被用作药物和siRNA的载体，以逆转M2 TAM引起的免疫抑制。此外，将TAM重新编程为M1表型也是另一种策略。用来自M1巨噬细胞的外泌体的模拟纳米囊泡治疗在体外和体内可以刺激M2巨噬细胞极化为M1表型，静脉注射动物模型抑制体内肿瘤生长；与PD-L1联合使用后，抗肿瘤作用进一步增强。

利用光声成像技术可以观察到负载有氯e6光敏剂（Ce6-R-Exo）的肿瘤衍生修饰外泌体，并能在激光照射下有效地在肿瘤细胞中产生活性氧。它们还可以增加了细胞因子的释放，表明R-Exos可以用作药物载体和免疫治疗药物。

外泌体含有肿瘤抗原，可作为癌症免疫治疗的疫苗。DC衍生的外泌体可装载多种肽抗原（例如MHC I、MHC II），从而刺激CD4+辅助性T细胞和CD8+CTL以诱导抗肿瘤反应。例如，皮下注射TAE-DC疫苗可显著恢复TME中激活的T细胞，并提高治疗效果。

目前的治疗策略主要集中在抑制癌细胞来源的外泌体的产生以及阻止靶细胞摄取特定的外泌体。GW4869是外泌体分泌和中性鞘磷脂酶的抑制剂，可抑制外泌体的产生并实现抗肿瘤作用。载有化疗药物（如阿霉素和紫杉醇）的外泌体可以用作新型纳米制剂，在癌症转移模型小鼠中显示出高效抗癌能力。

小结

外泌体及其内容物在介导肿瘤和TAM之间的串扰以及重编程宿主免疫反应中起着至关重要的作用。TAMs与免疫逃逸相关，可抑制抗肿瘤免疫，促进肿瘤进展。因此，靶向外泌体并抑制其对TAM的有害影响为活性抗肿瘤药物的开发开辟了新的视角，通过修饰外泌体将TAM重新编程为M1表型可以作为抑制肿瘤生长的一种有希望的策略。

尽管在这一领域取得了一些实质性的成就，但生物体内外泌体的通讯网络仍远未被完全理解。因此，对外泌体、TAM以及肿瘤细胞之间的信息传递机制以及作用机制的进一步理解，将有助于进一步的治疗开发和临床应用。

参考文献：

1.Exosome-Mediated Crosstalk Between Tumor and Tumor-Associated Macrophages. Front Mol Biosci. 2021; 8: 764222.

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