中药抗结肠癌！浙中医大附一&省肿瘤医院揭示香连丸调节肠道菌和胆汁酸代谢减轻高脂饮食相关性结肠癌

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导读

先前研究表明，高脂肪饮食（HFD）与肠道菌群紊乱和代谢紊乱密切相关，可促进结肠癌（CRC）发展。香连丸（XLP）是一种公认的传统方剂，在控制肠道菌群失调和炎症方面具有独特的优势。然而，它对HFD相关CRC的治疗作用在很大程度上仍然未知。本研究旨在探讨XLP拮抗HFD相关CRC的抗癌机制。我们采用偶氮甲烷（AOM）和右旋糖酐硫酸钠（DSS）诱导的HFD小鼠CRC模型，评价XLP的保护作用；使用16S rDNA和液相色谱/质谱分析检测XLP对肠道微生物群及其代谢产物的影响；此外，使用抗生素（Abx）构建了一个伪无菌小鼠模型，以验证肠道微生物群和代谢产物是否在CRC的发病机制中发挥作用。结果发现，XLP以剂量依赖的方式抑制结直肠癌的发生。并且XLP通过减少促炎细胞因子（如IL-6和TNF-α）的表达以及促炎巨噬细胞的浸润来保护肠道屏障的完整性。XLP在机制上抑制TLR4/MyD88通路，增加了益生菌（特别是阿克曼菌）的比例，并显著减少了粪便脱氧胆酸（DCA）。此外，在Abx处理后，XLP对CRC未显示出明显的抗肿瘤作用。同时补充DCA促进了结肠肿瘤的发生，并引发了明显的结肠炎症、M1巨噬细胞浸润和结肠损伤。在体外，用DCA处理的RAW-264.7巨噬细胞和正常肠上皮细胞的结果证实了体内发现，证明了炎症反应和肠屏障蛋白表达的模式一致。

亮点：

1.XLP抑制HFD相关的结肠直肠肿瘤发生。

2.XLP抑制TLR4/MyD88炎症通路。

3.XLP调节肠道微生物群和胆汁酸代谢。

4.抗生素缓解了XLP在小鼠中的抗癌作用。

5.脱氧胆酸促进结肠直肠癌的肿瘤发生和炎症。

论文ID

原名：Traditional medicine Xianglian pill suppresses high-fat diet-related colorectal cancer via inactivating TLR4/MyD88 by remodeling gut microbiota composition and bile acid metabolism

译名：中药香连丸通过重塑肠道微生物群组成和胆汁酸代谢失活TLR4/MyD88抑制高脂饮食相关性结肠癌

期刊：Journal of Ethnopharmacology

IF：4.8

发表时间：2024.05

通讯作者：郭勇&陈海涛

通讯作者单位：浙江中医药大学附属第一医院&浙江省肿瘤医院

实验设计

实验结果

1. XLP抑制HFD相关结直肠肿瘤的发生

生物活性成分是决定中药方剂疗效的关键。我们使用LC-MS研究XLP的成分。如表1所示，前五种成分是黄连素，其次是玉兰碱、dibutylphthalate、粉防己碱和黄连碱。然后，为了探索XLP对HFD相关结直肠肿瘤发生的影响，我们用758 mg/kg（低）或1516 mg/kg（高）的XLP每日剂量处理HFD喂养的癌症（CRC）小鼠（图1A）。三组总生存时间存在明显差异（图1B）。如图1C所示，XLP剂量依赖性地抑制了体重减轻。与此一致，XLP干预在抑制结肠缩短和肿瘤数量方面是有效的（图1D）。此外，XLP处理显著改善了组织学损伤并抑制了细胞增殖，分别通过苏木精和伊红（HE）染色和Ki-67染色证实了这一点（图1E）。鉴于巨噬细胞浸润和结肠炎症在结直肠癌癌症进展中的重要联系，我们研究了巨噬细胞极化对HFD相关肠道炎症的影响。研究结果表明，与HFD喂养的CRC小鼠相比，XLP处理小鼠中的结肠巨噬细胞的CD86表达较少，但不表达CD206（图1F）。此外，XLP还显著降低血清和结肠iNOS水平（图1G）。在HFD组和XLP组之间，血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）和天冬氨酸氨基转移酶（AST）水平（肝功能标志物）或肌酸酐（CREA）水平（肾功能指标）没有显著差异（图1H），强调了XLP的安全性。

表1 XLP中排名前五的成分

图1 XLP抑制HFD相关的CRC，并减轻结肠促炎巨噬细胞的浸润。（A）研究设计的示意图。（B）存活率。（C）体重变化。（D） 三组的结肠长度、肿瘤数量和代表性结肠图像。（E）HE染色和组织学评分，IHC染色和Ki-67指数分析（比例尺，50μm）。（F）统计流式细胞术图显示CD11b+CD86+细胞和CD11b/CD206+细胞在总CD11b+巨噬细胞中的比例。（G）血清和结肠组织中iNOS的水平。（H）血清ALT、AST和CREA水平（*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001）。

2. XLP抑制TLR4/MyD88通路的激活，改善炎症，维持黏膜屏障完整性

免疫荧光染色和蛋白质印迹分析表明，与XLP-L组相比，HFD组的结肠组织中TLR4和MyD88的表达显著上调（图2A和B）。XLP抗炎特性的研究涉及血清和结肠中炎症细胞因子水平的评估。XLP给药后，血清IFN-γ、IL-17和IL-1β水平下降（图2C）。同时，XLP导致结肠中IL-6、TNF-α和切割的IL-1β表达受到抑制，IL-1β水平没有显著变化（图2D）。为了证实XLP对黏膜屏障完整性的修复作用，我们评估了紧密连接蛋白在结肠中的表达。XLP-L组出现Zonula Occludens-1（ZO-1）和occludin的蛋白表达显著升高（图2E）。考虑到腺瘤是由异常细胞增殖引起的，我们检测了增殖细胞核抗原（PCNA）的蛋白表达，以及与WNT相关信号通路相关的RNA水平。研究结果表明，与HFD组相比，XLP处理的小鼠中PCNA蛋白水平以及β-连环蛋白、Axin2、WNT10a、WNT6和cMyc的RNA水平显著降低（图2F和G）。

图2 XLP抑制TLR4/MyD88通路并改善结肠炎症和肠道屏障功能障碍。（A）HFD和XLP-L小鼠结肠组织的代表性TLR4（红色）、MyD88（绿色）和DAPI（蓝色）免疫荧光染色。（B）TLR4和MyD88在HFD和XLP-L小鼠结肠组织中的表达水平。（C）ELISA法检测血清中IL-1β、IFN-γ、IL-17和IL-6水平。（D）使用蛋白质印迹和定量分析法测定HFD和XLP-L小鼠结肠组织中IL-1β、IL-6、TNF-α和切割的IL-1β的表达水平。（E）定量分析肠道屏障相关蛋白ZO-1和occludin在结肠组织中的表达水平。（F）PCNA蛋白表达。（G）通过qRT-PCR检测结肠组织中的β-连环蛋白、Axin2、WNT10a、WNT6和c-Myc mRNA水平（*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001）。

3. XLP重塑肠道微生物群

为了强调肠道菌群在暴露于HFD的CRC模型小鼠进展中的关键作用，我们进行了一项全面的分析，以评估微生物组组成的变化。我们使用16s rDNA测序分析第5周和第10周两组（HFD组和XLP-L组）的粪便样本。在第5周和第10周之间，总体微生物分布相对一致。尽管在第5周Shannon指数没有差异，但XLP-L组的OTU、Chao1和Simpson指数值低于HFD组（图3A）。在第10周，与HFD组相比，XLP-L组的细菌丰度和多样性进一步降低（图3B）。虽然主坐标分析（PCoA）显示，在第5周时，HFD组和XLP-L组之间没有明显的差异，但在第10周时，在HFD组与XLP-L小组之间出现了肠道微生物群聚集的显著差异（图3C和D）。

第5周和第10周两组细菌门水平的相对丰度分别如图3E和F所示。在细菌门的水平上，排名前三的细菌门是疣微菌门、厚壁菌门和拟杆菌门（图3G）。XLP处理后，疣微菌的丰度显著增加，而厚壁菌门的丰度降低。此外，从第5-10周开始，这种差异进一步扩大。此外，与HFD组相比，尽管XLP-L组的拟杆菌门丰度相对较低，但差异并不显著。

前20个属在第5周和第10周的组成分布在直方图中直观地表示（图3H和I），以评估属水平的差异。XLP处理促使有益菌的富集，特别是阿克曼菌、拟杆菌和UBA1819，如图3J所示。同时，在第5周，与HFD组相比，XLP-L组的Muribaculaceae和乳杆菌水平明显较低。从第5-10周开始，这种差异进一步扩大。Clostridium_sensus_stricto_1在第5周被XLP富集，而在第5至10周则被XLP降低。

图3 XLP治疗可逆转微生物微生态失调。（A）第5周肠道微生物群的阿尔法多样性（observed_OTU、Chao1指数、Shannon指数和Simpson指数）。（B）第10周肠道微生物群的alpha多样性（observed_OTU、Chao1指数、Shannon指数和Simpson指数）。（C）第5周肠道微生物群的β多样性（PCoA）。（D）第10周肠道微生物群的β多样性（PCoA）。（E）第5周肠道微生物群的门水平。（F）第10周肠道微生物群的门水平。（G）第5周和第10周肠道微生物群（疣微菌门、厚壁菌门和拟杆菌门）在门水平上的详细比较。（H）第5周肠道微生物群的属水平。（I）第10周肠道微生物群的属水平。（J）第5周和第10周属水平肠道微生物群（阿克曼菌属、拟杆菌属、UBA1819、Muribaculaceae、乳酸杆菌和Clostridium_sensus_stricto_1）的详细比较（*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001）。

4. XLP恢复HFD相关CRC的代谢功能障碍

鉴于与肠道微生物群相关的代谢产物的变化在CRC的发展中也很重要，我们随后对HFD和XLP-L组的粪便样本进行了代谢分析。如图4A所示，主成分分析（PCA）和PLS判别监督分析（PLS-DA）都显示出代谢产物与HFD和XLP-L组的明显分离。我们进一步进行；额通路富集分析，如图4B和C所示。在这些途径中，XLP显著下调次级代谢产物的生物合成和胆汁分泌。因此，我们进一步展示了胆汁酸相关代谢产物（图4D）。更详细地说，XLP显著降低了粪便中胆酸、脱氧胆酸、鹅去氧胆酸和牛磺胆酸的水平（图4E）。XLP也显著降低了结肠中脱氧胆酸的水平（图4F）。我们进行了深入的相关性分析，以阐明肠道微生物群改变和代谢变化之间的相互作用，显示粪便样本中微生物组和代谢组之间的正相关或负相关（图4G）。总之，这些发现表明，肠道微生物群和胆汁酸代谢之间的相互作用可能是XLP在HFD相关CRC抑制中的治疗机制的基础。

图4 XLP改变肠道微生物群相关代谢产物。（A）通过主成分分析（PCA）和偏最小二乘判别分析（PLS-DA），HFD和XLP-L小鼠的粪便代谢谱存在显著差异。（B）HFD和XLP-L小鼠中差异富集代谢产物的通路分析。（C）KEGG富集散点图。（D）粪便代谢产物的热图主要与胆汁酸有关。（E）胆酸、脱氧胆酸、鹅去氧胆酸、牛磺胆酸的详细描述。（F）通过LC-MS测试DCA的相对丰度。（G）肠道微生物群与代谢产物的相关性分析（*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001）。

5. XLP抑制肿瘤形成：肠道微生物群和细菌衍生代谢产物

在证实了XLP对CRC发展的抑制作用后，我们通过定期服用抗生素创建“伪无菌”小鼠模型，继续研究肠道微生物群的促进作用（图5A）。Abx和Abx+XLP组的体重和肠腺瘤的比较分析显示没有显著差异（图5B和C）。然而， Abx+XLP组的结肠长度超过了Abx组，这表明XLP在这种情况下产生了微妙的影响。

此外，免疫组织化学分析显示，Abx和Abx+XLP组的病理评分和PCNA、TLR4和MyD88蛋白水平没有统计学意义的差异（图5D）。类似地，蛋白质印迹也显示PCNA、occludin、活性-β-连环蛋白和切割的IL-1β的蛋白质水平没有统计学上的显著差异（图5E）。两组结肠组织中DCA水平没有统计学差异（图5F）。因此，XLD可能通过肠道菌群和细菌衍生代谢产物（DCA）发挥其抗肿瘤活性。

图5 XLP抑制涉及微生物群依赖性成分的HFD相关CRC。（A）研究设计的示意图。（B）体重变化。（C）两组的结肠长度、肿瘤数量和代表性结肠图像。（D）HE染色和组织学评分，IHC染色和定量分析小鼠结肠的PCNA、TLR4和MyD88（比例尺，50μm）。（E）应用免疫印迹和定量分析法检测Abx和Abx+XLP小鼠结肠组织中PCNA、occludin、活性-β-连环蛋白和切割的IL-1β的表达水平。（F）通过LC-MS测试DCA的相对丰度（*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001）。

6. DCA促进结直肠肿瘤发生，促进炎症，破坏肠道屏障

为了验证DCA的潜在促瘤作用，利用“伪无菌”小鼠模型，我们建立了CON和DCA组（图6A）。通过体内研究，DCA具有促进结肠缩短和增加结肠腺瘤数量的能力（图6B）。此外，DCA显著增强了M1巨噬细胞的浸润（图6C），提高了TNF-α的蛋白水平，并减弱了occludin的蛋白水平（图6D）。

图6 DCA在体内促进结直肠肿瘤的发生。（A）研究设计的示意图。（B）两组的结肠长度、肿瘤数量和代表性结肠图像。（C）显示CD11b+CD86+细胞在总CD11b+巨噬细胞中比例的统计流式细胞术图。（D）使用免疫印迹和定量分析，在CON和DCA小鼠的结肠组织中occludin和TNF-α的表达水平（*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001）。

体外研究表明，DCA显著提高了RAW264.7细胞中TNF-α、切割的IL-1β和NLRP3的蛋白质表达水平（图7A）。细胞周期分析显示，DCA阻碍了CCD841和HCoEpiC细胞从G1期到S期的细胞周期进程，从而促进结肠上皮细胞周期停滞（图7B），DCA处理后细胞周期蛋白D1蛋白水平降低证实了这一点（图7C）。重要的是，DCA显著降低了CCD841和HCoEpiC细胞中occludin蛋白的表达（图7C）。

图7 DCA会导致肠道屏障功能障碍和炎症损伤。（A）使用蛋白质印迹和定量分析，在Raw264.7巨噬细胞和DCA处理的Raw264-7巨噬细胞中IL-6、切割的IL-1β和NLRP3的表达水平。（B）用碘化丙啶（PI）对用或不用DCA处理的CCD841和HCoEpiC细胞进行染色，并使用流式细胞术进行分析。（C）用或不用DCA处理的CCD841和HCoEpiC细胞中细胞周期相关蛋白Cyclin D1和肠道屏障相关蛋白occludin的表达水平（*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001）。

癌症（CRC）的发病率与饮食因素密切相关，尤其是富含营养素、膳食脂肪或碳水化合物的饮食。人们在各种流行病学研究中已经观察到HFD和CRC发病率之间的强烈关联。一项饮食互换研究为饮食变化对CRC风险的影响提供了新的证据，在该研究中，非裔美国人的CRC发病率高于南非农村。目前，其全球发病率正在稳步上升，部分原因是发展中国家饮食习惯的改变。由于HFD与CRC的发展密切相关，我们决定探索与HFD相关的CRC并开发最佳药物。

长期以来，中医药因其对包括CRC在内的各种疾病的治疗效果而被公认。香连丸（XLP）是一种著名的中药配方，用于治疗胃肠道疾病已有数百年的历史。本研究深入探讨了XLP在HFD诱导的CRC小鼠模型中的抗癌特性。在该模型中，XLP以剂量依赖的方式有效地减轻了结肠缩短并降低了肿瘤负荷。此外，它显著抑制了肠道损伤和结肠细胞的异常增殖，并进一步抑制了WNT信号通路。重要的是，XLP的抗癌作用是在表现出高安全性和耐受性的剂量下实现的。即使在较低的浓度下，XLP也表现出显著的抗癌功效，使其成为抑制CRC的潜在药物。

对临床样本的研究表明，CRC患者早期可能会发生微生物变化，导致患者和健康人的肠道菌群组成存在显著差异。一些动物实验也证明了微生物群组成的变化与CRC发病机制之间的关系。同时，大量研究证实了XLP的抗炎特性及其恢复肠道微生物群失调的能力。认识到肠道菌群稳态的破坏会导致结直肠癌的发生，我们试图研究XLP、肠道菌群和结直肠癌发生之间的相互作用。在我们的研究中，XLP处理后，HFD喂养的CRC小鼠中富集了益生菌阿克曼菌、Parabacteroides和UBA1819。阿克曼菌以其有益菌的特性而闻名，临床研究证明，与CRC患者相比，健康人群的样本显著富集。此外，Lu Zhang及其同事报道，嗜黏蛋白阿克曼菌通过AhR/β-catenin信号通路抑制色氨酸代谢，以对抗癌症的进展。阿克曼菌也被报道可以直接调节CD8+T细胞并改善宿主代谢功能，从而抑制CRC的发展。此外，据报道，在HFD喂养的AOM处理小鼠中，Parabacteroides可减弱TLR4信号传导和Akt激活，并阻断结肠肿瘤的形成，而UBA1819有望成为一种具有抗炎特性的益生菌。XLP诱导的肠道微生物群变化表明其可能对CRC中观察到的抗癌作用有贡献。

此外，XLP干预显著减少了与肠道炎症发展密切相关的条件致病细菌Clostridium_sensus_stricto_1。重要的是，XLP还显著降低了Muribaculaceae和乳杆菌的相对丰度。上述三种肠道菌群都与BA代谢密切相关。众所周知，BA代谢在维持肠道稳态和影响CRC发展方面发挥着关键作用。本研究对人类受试者和小鼠模型的研究都强调了BA的促炎和致瘤特性，特别是通过细菌代谢产生的次级BA。临床研究结果还表明，患有结直肠腺瘤的男性血清DCA水平显著较高，这在本研究中得到了验证。在我们的体内实验中，我们专注于解读BA代谢的作用。与现有研究结果一致，HFD组的一系列BA上调，但在服用XLP后显著下调。相关性分析进一步显示，粪便中的微生物组和代谢组之间存在正相关和/或负相关，揭示了肠道微生物组和微生物组衍生代谢产物之间的密切关系。为了更好地阐明肠道菌群和相关代谢产物（这里主要是DCA）在XLP抗癌作用中的作用，我们建立了一个伪无菌CRC小鼠模型。当肠道微生物群耗尽时，XLP的抗癌作用消失，并且结肠DCA水平在Abx和Abx+XLP组之间没有显著差异。此外，在HFD喂养的伪无菌CRC小鼠中补充DCA促进了CRC的发育。总之，XLP诱导的肠道微生物群和BA代谢的改变可能是其抗CRC抗癌作用的基础。

肠道微环境的改变，包括炎症和屏障完整性功能障碍，也在CRC的发展中发挥着直接和关键的作用。TLR4/MyD88是一种经典的炎症信号通路，与肠道微生物群密切相关。在我们的研究中，XLP能够显著抑制TLR4通路。然而，XLP对TLR4途径的影响在肠道菌群清除后消失。此外，巨噬细胞在肠道环境中的免疫调节中起关键作用，并负责促炎细胞因子的分泌，如TNF-α。在本研究中，XLP严重减少了M1巨噬细胞的数量。相应地，XLP在降低血清和结肠炎症标志物水平方面表现出疗效，包括TNF-α、IL-6和切割的IL-1β。考虑到重新吸收的DCA在结肠固有层中的潜在积累，我们推测HFD相关CRC小鼠的结肠巨噬细胞可能会遇到DCA，可能会引发M1极化。因此，我们进一步进行了体外实验，以研究DCA、巨噬细胞极化和结肠炎症之间的相互作用。我们发现DCA显著增加了RAW264.7细胞中TNF-α、裂解的IL-1β和NLRP3的蛋白表达水平，表明促炎巨噬细胞表型发生了变化。大量研究也表明TJ分子在CRC中的表达降低，这在本研究中得到了再次验证。XLP给药通过上调体内XLP组中ZO-1和occludin的表达，显著修复肠道屏障损伤。此外，我们发现DCA可以抑制CCD841和HCoEpiC细胞从G1期到S期的细胞周期进程，并显著降低正常肠上皮细胞中occludin的蛋白表达水平。

结论

总之，我们的研究揭示了在体内环境中对XLP在CRC中的抗癌特性的新见解。XLP恢复肠道微生物群失调，抑制BA代谢，抑制促炎（TLR4途径）和致癌（WNT途径）途径，减少M1巨噬细胞浸润，并保持肠道屏障完整性。除了XLP在体内对肠道微生物群和微生物相关BA的影响外，我们还在体外证明了DCA、正常肠上皮细胞和巨噬细胞之间的相互作用。总之，我们的研究阐明了肠道微生物群和BA代谢之间的复杂相互作用，形成了XLP阻碍TLR4/MyD88途径抑制CRC的治疗效果。这揭示了未来或许可利用XLP作为避免HFD相关CRC发作的靶向方法。

https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/38824980/

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