斑马鱼行为篇㊶：斑马鱼在听觉领域的应用

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斑马鱼是一种小型热带鱼类，身体呈纺锤形，全身布满多条深蓝色纵纹。雌鱼一年四季均可排卵，每次排卵可多至200余枚。斑马鱼体外受精、体外发育，由于其胚胎透明，因此整个发育过程均清晰可见。斑马鱼受精约120h后，各个组织与脏器即已发育完全。受精约3个月后，可达到性成熟。受精约5个月后，可达到体成熟。2005年斑马鱼的全基因组已完成测序，2013年英国的Sanger研究所完成了斑马鱼的参考基因组测序。研究人员在此基础上比较了斑马鱼与人类基因组的异同，并进行了系统的全基因组分析，深入解析了斑马鱼编码基因的功能。研究发现，约71.4%的人类基因在斑马鱼中均可找到至少一个同源基因，约69%的斑马鱼基因在人类中也可找到至少一个同源基因。除此之外，在生理结构、蛋白功能、细胞内部的信号通路等方面，斑马鱼也表现出与人类极高的相似性。斑马鱼作为一种介于细胞与哺乳动物之间的新型脊椎动物模式生物，在听力研究领域拥有巨大的潜力。以其作为实验动物，有助于科研人员对药物或化合物的耳毒性及耳毒性保护活性进行高通量的快速筛选评价。

斑马鱼的听觉器官

斑马鱼的听觉器官主要由内耳、韦伯氏器与侧线系统组成。成年斑马鱼的内耳包含3个耳石器官(椭圆囊、听壶、球囊)和3个相互垂直排列的半规管(前、后和水平半规管)。椭圆囊和3个半规管共同构成斑马鱼的前庭系统，该系统主要负责维持机体的平衡，且对重力加速度特别敏感，听壶与球囊则主要负责听觉的形成。在斑马鱼3个耳石器官的内部，各有一块加厚的区域，称为“囊斑”，相当于哺乳动物内耳中的柯蒂氏器(Corti’s organ)。斑马鱼的囊斑由密集的感觉毛细胞和支持细胞组成，两种细胞相互隔离，穿插排列。内耳中的感觉毛细胞是一种特化的上皮细胞，可以感受声波的机械振动。当外界的声音刺激以机械振动的方式传递至内耳感觉毛细胞时，感觉毛细胞顶端的纤毛会发生弯曲，继而引发纤毛膜离子通道的开放，导致膜的去极化，神经递质随即从感觉毛细胞底部释放。此时，外界的声音刺激即由机械振动转换成了可被听觉中枢识别的电信号。

韦伯氏器是斑马鱼前方几个椎骨发生异变形成的一组具有特定功能的骨片，负责将鱼鳔与内耳中的球囊相互连接。当外界的声音刺激鱼体时，鱼鳔可以加强声波的机械振幅。随后，经由鱼鳔放大的声波通过韦伯氏器可传递至球囊中的感觉毛细胞，从而最终产生听觉。通过韦伯氏器，斑马鱼可以感受到高频率、低强度的声音。

侧线系统是水生脊椎动物特有的皮肤感觉器官，能感受较低频率的震动，具有控制趋流向的定位作用，同时还能协助视觉测定远近物体的位置。斑马鱼的侧线系统包括两种机械感受器，分别是位于皮肤表面的神经丘以及位于皮肤下侧线管内的管道神经丘。神经丘是斑马鱼侧线系统的基本功能单位，每个神经丘中央均包含一簇受神经支配的感觉毛细胞，其功能主要为探测低频振动和局部水流，调控逃避、学习和捕食等行为。斑马鱼的侧线处感觉毛细胞在结构、功能、基因调控和对耳毒性药物的反应等方面，均与人类内耳感觉毛细胞非常相似。当斑马鱼受精约第5d时，其侧线神经丘处的感觉毛细胞即已发育完全。除此之外，由于部分神经丘毛细胞位于斑马鱼皮肤表面，因此其非常便于活体观察或干预。截至目前为止，斑马鱼的侧线神经丘已广泛应用于毛细胞的发育、再生和听觉障碍等研究当中。

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斑马鱼在听力研究领域的应用

• 药物耳毒性评价领域的应用：

耳毒性药物是指其毒副作用主要损害听觉系统，中毒症状为耳鸣、眩晕、耳聋和平衡失调等的一类药物。目前由于缺少简便而有效的耳毒性评价模型，因此临床上批准上市的药物大多数缺乏耳毒性的评价指标。

• 耳毒性保护药物筛选领域的应用：

氨基苷类抗生素是一种由氨基糖与氨基环醇通过氧桥连接而成的苷类抗生素，因具有抗菌谱广、抗菌能力强、用药成本低、过敏反应少等特点，在临床上应用非常广泛。目前，最常见的氨基糖苷类抗生素包括庆大霉素、新霉素、链霉素、妥布霉素和阿米卡星等。但是，这类药物具有较强的耳毒性，能够杀死哺乳动物内耳中的感觉毛细胞，导致听力的永久性损伤。截止目前为止，氨基糖苷类药源性耳聋尚无理想的治疗方法或者药物，所以应用合适的动物模型筛选防治该类疾病的药物显得至关重要。

• 毛细胞再生领域的应用：

哺乳动物内耳中的感觉毛细胞是一种终末分化的细胞，因此不可再生。如何通过技术手段，实现感觉毛细胞的再生，一直是听力研究领域的难题之一。2003年，Harris等首次报道，斑马鱼的感觉毛细胞在缺损后存在再生现象。因此斑马鱼模型在感觉毛细胞再生领域具有区别于哺乳动物的独特优势。通过研究斑马鱼感觉毛细胞再生的机制，有助于科研人员早日破解哺乳动物感觉毛细胞再生这一难题。斑马鱼再生的侧线感觉毛细胞多来源于表达Sox2基因的前体细胞。

斑马鱼在听力研究领域的常用技术方法：

• 活体染色技术

活体染色是指利用某些无毒或毒性小的染料，来标记动植物的组织和细胞，但是又不影响其生命活动或产生任何物理、化学变化以致引起动植物死亡的一种染色技术。斑马鱼由于体外受精、体外发育，且发育早期胚胎透明，因此特别适合活体染色。除此之外，由于斑马鱼的感觉毛细胞对某些特殊荧光染料如YO PRO1、FM1-43和FM4-64等具有选择吸收性，因此借助这些荧光染料和成像技术，可直接对其进行实时观察。

• 行为学技术

行为学技术多用于对实验动物的高级中枢神经功能、运动能力和精神状态等进行评估，可全面反映动物的整体状态。由于斑马鱼的听觉器官位于体表，因此很容易利用行为学技术对其听觉功能进行检测。这些行为学检测方法对斑马鱼听觉系统的功能评估来说，既经济又可靠，相应的技术简单且有效。由噪声引起的斑马鱼行为学的变化，可作为一种评估听力的有效方法。

• 基因编辑技术

基因编辑技术是近年来兴起的一种能够对目标基因进行定向“编辑”的技术。通过该技术，可实现对靶标基因的功能研究。截止目前为止，科研人员已在斑马鱼模型中发现了约50种听觉相关基因，这些基因中的许多种同样影响着人类和脊椎动物的内耳。因此利用基因编辑技术，对斑马鱼的听觉相关基因进行研究，将具有重要意义。应用CRISPR/Cas9技术构建的Mtu1基因表达缺陷的斑马鱼。该斑马鱼模型表现出听力障碍、惊吓反应与游泳行为异常等。除此之外，上述基因缺陷型斑马鱼内耳中与侧线处毛细胞的数量均明显减少，该研究为耳聋疾病的发病机制提供了新的理论依据。

• 转基因技术

转基因技术是指利用现代生物技术，将人们期望的目标基因，经过人工分离、重组后，导入并整合到生物体的基因组中，从而改善生物原有的性状或赋予其新的性状的一种技术。应用转基因技术，科研人员可实现斑马鱼听觉器官的特异荧光标记，或构建听觉相关基因表达缺陷的活体动物模型，为听觉领域的研究提供新的实验动物。

参考文献：

1、Mitochondrial calcium uptake underlies ROS generation during aminoglycoside-induced hair cell death[J]. Robert Esterberg;;Tor Linbo;;Sarah B Pickett;;Patricia Wu;;Henry C Ou;;Edwin W Rubel;;David W Raible.Journal of Clinical Investigation,2016(9)

2、Embryotoxicity and hair cell toxicity of silver nanoparticles in zebrafish embryos[J]. Myung Hoon Yoo;;Yoon Chan Rah;;June Choi;;Saemi Park;;Hae-Chul Park;;Kyoung Ho Oh;;Seung Hoon Lee;;Soon-Young Kwon.International Journal of Pediatric Otorhinolaryngology,2016

3、斑马鱼胚胎图像的形态学特征分析[D]. 程磊.南京理工大学,2009

4、刘可春,高燕,张云,等.模式生物斑马鱼在听觉领域的应用[J].山东科学,2019,32(05):46-53.

5、Zebrafish swimming behavior as a biomarker for ototoxicity-induced hair cell damage: a high-throughput drug development platform targeting hearing loss[J]. Maki Niihori;;Terry Platto;;Suzu Igarashi;;Audriana Hurbon;;Allison M. Dunn;;Phi Tran;;Hung Tran;;Jordan A. Mudery;;Marvin J. Slepian;;Abraham Jacob.Translational Research,2015

6、Protective role of L‐ascorbic acid, N ‐acetylcysteine and apocynin on neomycin‐induced hair cell loss in Zebrafish[J]. Chia‐Yen Wu;;Han‐Jung Lee;;Chi‐Fang Liu;;Mallikarjuna Korivi;;Hwei‐Hsien Chen;;Ming‐Huan Chan.J. Appl. Toxicol.,2015(3)

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