被自己的 co-IP 蛋白条带「气」笑啦（附 IP/co-IP 自查指南）

科研新手村村长

我的 co-IP 始终拉不下来蛋白？开题答辩 ddl 迫在眉睫，老脸不保了。

峡谷打怪升级的师兄

正好相反，我当初阴性（空白）对照也能拉下来蛋白，气笑了！一度怀疑生物学不复存在。

装备丰富的大师姐

别担心，我总结了前人三十多年的 IP/co-IP 实战经验及常见问题，你们的问题里面都能找到答案，进阶 IP 大神不是梦（文中附资料包下载入口）。

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co-IP 实验从样品制备、试剂选择、抗原-抗体结合、洗脱等任何环节出现 bug，都可导致结果不理想。此外还会出现背景深、目的条带位置不对、纯化抗原得率低等情况。如何快速掌握这项实验，轻松搞定各种疑难杂症呢？不用担心，现点击下方图片或扫码即可免费下载「免疫沉淀（IP）技术指南和实验方案」、「IP/Co-IP 常见问题解析汇总」等资料包，文末还有大师姐的视频讲解，助大家早日驾驭 IP、co-IP。

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一. IP，co-IP 和 Pull down 实验如何选？

IP（Immunoprecipitation），免疫沉淀：是利用固定在磁珠或琼脂糖树脂等基质上的特异性抗体对抗原进行小型亲和纯化的一种方法

Co-IP（co-Immunoprecipitation），免疫共沉淀：co-IP 是一种常用的鉴定蛋白-蛋白相互作用的方法，其基本实验流程和 IP 类似，通过使用诱饵蛋白（IP 中的抗原，bait protein）特异性抗体间接捕获与其结合的靶蛋白（prey protein）。

Pull-down：另外一种进行蛋白-蛋白相互作用研究的方法，针对无法找到可用的抗体的靶蛋白。可以采用一个表位标记标记蛋白质（可在细胞内组成型表达），将其固定在基质上获得互作蛋白。很多蛋白质由于无法找到可用的抗体而无法进行免疫沉淀。

二. 实验设计如何正确设置对照？

阳性对照：证实细胞裂解物中确实存在靶蛋白（IP）或者互作蛋白对（co-IP，比如诱饵蛋白 X 和靶蛋白 Y），即为常说的input。可直接取抽好的蛋白溶液进行 Western。

阴性对照：用来排除假阳性。设计时考虑到整个实验体系会出现的 beads、抗 X 抗体、诱饵蛋白 X、靶蛋白 Y（co-IP）：

*注意：

1. 总蛋白上样量过多也会造成非特异性结合，建议上样量为 500 ug～1 mg。上样之前一定要先用 BCA 定个量！定个量！定个量！

2. 内源性 co-IP 实验，结果为阴性，两个蛋白不一定没有相互作用。可能存在弱相互作用力，需要交联剂协助，锁定强化弱互作蛋白；也有可能是内源蛋白表达量低，可先做过表达 co-IP 作为对照。

三. 孵育（结合）顺序与孵育条件

抗体，裂解液，beads，如何排列组合？会有怎样的影响？

从以上三个结果可以看到，第一种孵育方法抗原得率最高，第三种抗原得率最低。如果靶蛋白丰度较高，第一种和第二种差别并不显著。注意，整个体系选择同样的孵育顺序，以确保结果的重复性。

四. 常见问题分析及解决方法

1. Co-IP 背景较深或者条带杂乱

● 原因：填料的非特异性结合；抗体结合非特异的蛋白；洗涤不当造成杂带

● 建议方案：pre clear 琼脂糖填料或者更换成磁珠；设置对照排除非特异性条带；优化缓冲液

2. Input 条带清晰，co-IP 条带很弱？

● 原因：设 X 为诱饵蛋白，Y 为靶蛋白，有可能为 X 和 Y 的相互作用本身比较弱；X 蛋白并不是 Y 的唯一，只部分 Y 与 X 互作

● 建议方案：可以尝试反向拉，比如用 Y 去拉 X，可能效果比较好

3. 我的蛋白正好和抗体重链分子量接近，要如何减少抗体干扰？

建议方案：

● IP/WB 一抗使用不同种属来源，选择与 IP 抗体种属无交叉反应的二抗（Cross Adsorbed secondary antibody）

● 特殊二抗：比如仅识别重链或者轻链的二抗，或者仅识别天然抗体的二抗

● 直接源头遏制：将抗体直接交联到 bead 上，或者将抗体交联到 protein A/G 上，避免洗脱干扰

4. 靶蛋白没有条带

● 裂解液不合适，或者没有添加抑制剂，导致靶蛋白或者饵蛋白构象改变不能结合或者降解

● 饵蛋白较难洗脱，换成高强度的洗脱缓冲液

● 选用的抗体不合适，建议 IP 验证过的抗体，并优化下抗体用量

● 蛋白间为弱相互作用，或者相互作用依赖翻译后修饰

5. 琼脂糖难离心，每次总会吸上来一点儿

建议方案：

● 使用带滤膜的离心柱，下部有接样管，琼脂糖完全截留在滤膜上

● 换成磁珠

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试剂盒经过优化也可以帮助 IP/coIP 实验少走弯路，更快拿到结果。依据不同的实验情况，可以搭配不同的 IP/coIP 试剂盒。

1. 希望快速拿到稳定的实验结果，经典试剂盒由于经过了一系列的优化，更适合。

2. 希望背景更干净，减少抗体轻重链对结果的干扰，交联法试剂盒更适合。

3. 采用非传统抗体，与蛋白 A 或者蛋白 G 结合不好或者不结合，采用直接直接法。

内容策划：王丹琦

内容审核：吴军

题图来源：丁香实验