脑声问答（31）期丨明暗箱实验(LDB)的正确实验方法是什么？

明暗箱实验( light /dark box，LDB)也叫光/暗转换测试，是评价焦虑与抑郁情绪的经典方法，广泛应用于精神神经药理学基础研究：LDB具有较好的结构效度。明暗箱实验可用于研究与情绪障碍相关的疾病模型。明暗箱可用于测试大小鼠的无条件焦虑反应。它基于啮齿动物面对轻度应激源，例如新颖的环境和光线/开放空间时的先天避光和自发探索行为。通过比较正常小鼠和模拟特定疾病（如焦虑症、抑郁症）的小鼠在明暗箱中的行为差异。明暗箱利用啮齿类动物喜欢探究新奇环境，但又因厌恶明室中亮光而被迫退却，由此形成矛盾冲突状态，使穿箱次数减少。抗焦虑药物可显著增加鼠的穿箱次数以及在明室时间。

明暗箱装置示意图

明暗箱(45 cm × 27 cm × 27 cm)，木质，包括3部分: 大面积箱体(27 cm × 27 cm × 27 cm)，底部分成9个面积相等的方格( 9 cm × 9 cm) ; 小面积箱体(18 cm × 27 cm × 27 cm) ，底部分成6个面积相等的方格( 9 cm × 9 cm) ; 两箱体隔板( 可移动) 之中央通道( 7 cm × 7 cm) 。明箱区采用30 W白灯泡离箱底40 cm高处照明; 暗箱区采用 30 W红灯泡( 或其他实验彩色) 离箱底40 cm高处照明。还有其他的明暗测试箱为灰白色铝合金的封闭测试箱体，箱体内部用隔板分隔成明暗两室，明室顶部装有白光灯，照度可调为0到1200 lux，暗室照度为2 lux，隔板下方有一小门相通。测试箱顶部为控制电路板，顶部中间位置安装有摄像头，摄像头上装有红外截止滤镜，侧面装有红外背景光源 (波长850 nm，侧面平行照射，安装于2倍于鼠身体高度的位置，高度约为 (7-10 cm)，底部为不锈钢栅，钢栅下方有用于收集动物的排泄物的活动抽屉。数据分析则采用阈值分割法识别明暗箱中的动物，边缘法计算动物的质心并跟踪动物的运动轨迹，扣除“本底噪音”方式以及阈值法，剔除多种噪声。

实验步骤

操作者将昆明小鼠置于大面积箱体正中央格，用摄像系统记录动物5 min的行为变化，包括两箱停留时间、水平运动、垂直运动、穿梭次数以及粪便粒数; 其中，四只爪子均进入一格方可记录水平运动1次，两前爪腾空或攀 附墙壁方可记录垂直运动1次。操作者将小鼠放入明暗穿梭箱正中格，用摄像 系统记录动物5 min的行为变化，包括两箱停留时间、水平运动、垂直运动; 其中，四只爪子均进入一格方可记录水平运动1次，两前爪腾空或攀附墙壁方可记录垂直运动 1 次。每次实验后，用75%酒精擦拭箱体周壁及地面，以免动物残留物影响下次测试结果。

LDB影响因素

LDB实验条件影响因素主要考察昼夜节律(白天黑夜) 、光照面积(明箱区)、光照颜色(暗箱区)、光照强度(明箱区)以及昼夜节律与光照面积交互效应。其中，昼夜节律主要考察白天周期(18:00 -6:00; Day)、黑夜周期( 6∶00-18: 00; Night) 对实验动物LDB行为模式影响；光照面积主要考察眀箱区光照大面积箱体( L3/5)、小面积箱体(L2/5) 对实验动物LDB行为模式影响；昼夜节律与光照面积采用析因设计分组: Day-L3/5( n = 6) ，Day-L2/5( n = 6)，Night-L3/5( n= 6) ，Night-L2/5( n= 6) 。光照颜色主要考察暗箱区光照颜色黄色( Yellow，n = 6) 、绿色( Green，n = 6)、蓝色( Blue，n= 6)、红色(Red，n = 6)对实验动物LDB行为模式影响，明箱区采用30 W白灯泡光照; 实验周期选取Night。光照强度主要考察眀箱区光照强度15 W( n = 6) 、25 W( n = 6) 、40 W( n= 6) 、60 W( n= 6) 、100 W( n= 6) 对实验动物LDB行为模式影响，暗箱区采用30 W红灯泡光照；实验周期选取Night。

光照面积可明显影响LDB焦虑行为模式( Ltime%、Lcross%、Lrear%) ，且光照面积通过昼夜节律影响LD焦虑行为模式，尤其是与明箱区空间面积相比，白天周期 LDB焦虑行为( Lcross%、Lrear%) 明显增加; 光照颜色(黄光)可明显影响 LDB 探索行为模式(Rear)，光照强度 (100 W) 可明显影响LDB运动行为模式( Cross、Total)。同时，啮齿类动物情绪行为的形成与表达与先天遗传与后天环 境密切相关，而状态焦虑评价受外界环境及操作条件等 后天因素的影响更为明显，应注意到本研究可能存在的缺陷：①昼夜颠倒预适应环境周期仅1 w；②光照颜色是通过灯罩颜色过滤获取；③光照强度采用灯泡功率大小区分；上 述因素亦可能导致LDB行为模式一定程度的偏移。

统计指标

入明/入暗潜伏期、入明/入暗次数、穿箱次数、明室(暗室) 时间等基本的评价指标; 运动时间、静息时间、明室/暗室运动时间、明室/暗室静息时间、总路程、明室/暗室路程、运动速度等其余判断的指标。纳入实验参数：明区停留时间百分率(Ltime%)、明区水平运动百分率( Lcross%)、明区垂直运动百分率(Lrear%)、水平运动总得分(Cross) 、垂直运 动总得分(Rear)、总得分(Total = Cross +Rear)、穿梭次数 ( Transition)和两区粪便粒数( Lfbs，Dfbs) 及粪便总粒数( Fbs = Lfbs+Dfbs)。小鼠四爪全部通过中央通道才可记录为一次穿梭。

参考文献：

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7、张宏霞,吕静薇,张北月等.一种大小鼠明暗箱图像分析处理系统的研制[J].中国比较医学杂志,2018,28(04):43-49+72.

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9、Bourin M, Hascoët M. The mouse light/dark box test. Eur J Pharmacol. 2003 Feb 28;463(1-3):55-65.

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